جيل من التكامل خالية من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات من الخلايا الطرفية الإنسان الدم وحيدات النوى عن طريق Episomal المتجهات

الهدف العام من هذا الإجراء هو توليد خلايا iPS من خلايا أحادية النواة في الدم المحيطي البشري البالغ باستخدام نواقل عرضية غير متكاملة. يمكن أن يساعد هذا البروتوكول العلماء في مجال الخلايا الجذعية الذين يرغبون في توليد خلايا iPS لمراقبة المرض وفحص الأدوية والطب الإشعاعي المنتظم. بروتوكول إعادة البرمجة الخاص بنا بسيط للغاية ولكنه عالي الكفاءة.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن للمرء بسهولة إتقان تقنية إعادة برمجة خلايا الدم. جودة البلازما لا تقل أهمية عن إعادة البرمجة الناجحة. قد تقلل الملوثات من كفاءة إعادة البرمجة ، لذلك نوصي باستخدام مجموعات Endofree لتنقية البلازميدات العرضية.

خلايا iPS أكثر هشاشة من الخلايا الأخرى. قد يؤدي تحضير الخلايا لأكثر من واحدة أثناء تمرير الجين إلى موت خلايا هائلة ، لا سيما في الممرات المبكرة. لبدء هذا الإجراء ، قم بإعداد جميع وسائط الثقافة المطلوبة وفقا للمخطوطة المصاحبة.

ثم امزج 10 مل من عينة PB الطازجة وعشرة مل من المخزن المؤقت PBS في أنبوب سعة 50 مل واخلطه جيدا. اجلب PBS إلى درجة حرارة الغرفة أو 37 درجة مئوية قبل الاستخدام. بعد ذلك ، أضف 10 مل من ficoll إلى قاع الأنبوب.

يجب تنفيذ هذه العملية ببطء لضمان عدم اختلاط طبقة ficoll مع PB. الطرد المركزي للخليط على حرارة 400 × جم لمدة 30 دقيقة مع تسارع وتباطؤ منخفضين. بعد الطرد المركزي ، تكون PB MNCs في الطبقة البيضاء الواقعة بين بلازما PB و ficoll. استنشق ببطء 10 مل من بلازما PB دون إزعاج طبقة برتقالي.

ثم احصد الطبقة البيضاء بعناية في أنبوب جديد سعة 50 مل. يجب أن يكون الحجم الإجمالي للخلايا التي تم جمعها من الطبقة البيضاء حوالي ثلاثة إلى ستة مل. بعد ذلك ، أضف PBS ليصل الحجم الإجمالي إلى 30 مل واخلطه جيدا.

ثم الطرد المركزي للعينة عند 400 × جم لمدة عشر دقائق. بعد عشر دقائق ، قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في 20 مل من وسط الاستزراع. اخلطي جيدا وقم بالطرد المركزي للعينة على حرارة 400 × جم لمدة خمس دقائق لإزالة غالبية الصفائح الدموية.

بعد ذلك ، قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في مل إلى مل واحد إلى اثنين من IMDM. يمكن استخدام الخلايا للزراعة الفورية أو تجميدها لاستخدامها لاحقا. للحفظ بالتبريد، أضف كمية متساوية من وسيط الحفظ بالتبريد.

بتقطيع الخلايا إلى كريفيال وانقلها إلى ثلاجة 80 درجة مئوية على الفور. في هذا الإجراء ، قم بإعداد خمسة مل من وسيط IMDM في أنبوب 15 مل. قم بإذابة الخلايا متعددة الجنسيات PB المجمدة بسرعة في حمام مائي 37 درجة مئوية قبل نقلها إلى الأنبوب باستخدام وسيط IMDM.

الطرد المركزي العينة عند 400 × جم لمدة خمس إلى عشر دقائق. بعد ذلك ، قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في وسط الكريات الحمراء. ثم عد الخلايا تحت المجهر باستخدام مقياس كثافة الدم.

بعد ذلك ، عالجت الخلايا متعددة الجنسيات PB المزروعة في زراعة غير الأنسجة ستة ألواح آبار بمللي من الوسط لكل بئر عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطبة بنسبة 5٪ من ثاني أكسيد الكربون. في يوم واحد وثلاثة وخامس ، أضف مل واحد من وسط الكريات الحمراء الطازجة مباشرة في كل بئر دون تغيير الوسط. في اليوم السادس ، قم بحصاد PB MNCs من أجل النواة.

قبل يوم واحد من النواة ، قم بتغطية ثقافة الأنسجة المعالجة بستة ألواح جيدة بنسبة 0.1٪ جيلاتين عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. قم بإذابة خلايا التغذية MEF المعطلة في حمام مائي 37 درجة مئوية وانقلها على الفور إلى أنبوب سعة 15 مل يحتوي على خمسة مل من وسط MEF. بعد ذلك ، قم بطردها بمعدل 400 × جم لمدة خمس دقائق وقم بإزالة المادة الطافية.

ثم قم بإزالة الجيلاتين من صفيحة الآبار الستة وأعد تعليق حبيبات الخلية في وسط MEF. بعد ذلك ، قم بزرع خلايا MEF المعطلة في مللي من وسط MEF في كل بئر من ستة ألواح جيلاتين معالجة مسبقا وزراعتها عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطبة بثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪. في يوم النواة ، استنشق وسط MEF واستبدله بمل واحد من وسط الكريات الحمراء.

ثم قم بموازنة لوحة الثقافة مسبقا لمدة 10-30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطبة بثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪. أضف ميكروغرامين من PEV OCT4 إلى Sox2 ، وميكروغرام واحد من PEV MYC ، وميكروغرام واحد من PEV KLF4 ، و 0.5 ميكروغرام من PEV Bcl-XL في أنبوب معقم سعة 1.5 مل. قم بتسخين الأنبوب على حرارة 50 درجة مئوية لمدة خمس دقائق لمنع التلوث ثم قم بتبريده إلى درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك ، أضف 57 ميكرولتر من المخزن المؤقت للنوة و 13 ميكرولترا من المخزن المؤقت المكملات إلى العينة. احصد مرتين في عشرة إلى سادس PBMNCs المستزرعة إلى أنبوب خمسة مل عن طريق الطرد المركزي عند 200 × جم لمدة سبع دقائق. بعد ذلك ، قم بإزالة المادة الطافية وأضف مزيج البلازميد والمخزن المؤقت للنواة إلى حبيبات الخلية.

ثم تخلط جيدا عن طريق النقر على الأنبوب بإصبعك. بعد ذلك ، انقل الحمض النووي في تعليق الخلية إلى الكوفيت الذي توفره المجموعة وقم بتغطية الكوفيت. حدد البرنامج U-008 على جهاز النواة.

بعد ذلك ، أدخل الكوفيت في الحامل واضغط على موافق. بعد ذلك ، أخرج الكوفيت من الحامل. أضف 0.5-1 مل من وسط الكريات الحمراء الدافئ مسبقا إلى كل كوفيت وانقل الخلايا إلى لوحة MEF المتوازنة مسبقا على الفور. بالنسبة لبعض العينات، قد تحصل على آلاف المستعمرات من ميل واحد من الدم.

إذا كنت ترغب في اختيار مستعمرة واحدة لمزيد من الثقافة ، فقد تحتاج إلى زرع بئر إضافي مع 1 مليون خلية فقط. قبل وضع غرفة نقص الأكسجة في الحاضنة مباشرة ، قم بهز الغرفة برفق عدة مرات لإنشاء توزيع متساو للخلايا في آبار الاستزراع. ثم انقل اللوحة إلى غرفة نقص الأكسجة.

اغسل الغرفة بغاز مختلط لمدة دقيقة إلى دقيقتين بمعدل 20 لترا في الدقيقة. بعد ذلك ، أغلق الغرفة واستزراع العينة عند 37 درجة مئوية. في اليوم الثاني بعد النواة, إضافة اثنين مل من وسط iPSC مباشرة في كل بئر.

في اليوم الرابع بعد النوكليوفكتيون, إزالة ثلاثة مل من الوسط وإضافة اثنين مل من الوسط iPSC الطازجة. في هذه المرحلة ، ترتبط معظم الخلايا الحية بطبقة التغذية. بعد اليوم السادس بعد النوة ، قم بتغيير الوسط كل يومين عن طريق ترك 500 ميكرولتر من الوسط المستهلك وإضافة مللي من وسط E8 الطازج المكمل ب 0.25 ملليمولات من زبدات الصوديوم حتى الأيام 14-18.

يظهر هنا مخطط لبروتوكول إعادة برمجة خلايا الدم المحيطية. تظهر هذه الصورة AP واقفا في وعاء ، وتظهر هذه الصورة مستعمرة iPSC نموذجية تشبه ESC في اليوم 14 بعد نوة PB MNCs. فيما يلي مخططات FACS التمثيلية ل iPSCs في المقطع الخامس للتعبير عن TRA-1-60 أو SSEA4.

فيما يلي الصور التمثيلية متحدة البؤر لمستعمرات iPSC التي تعبر عن NANOG و OCT4. تظهر الصور هنا تلطيخ H & E للطين ، الذي يتألف من جميع الطبقات الجرثومية الثلاث. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنشاء خلايا iPS خالية من التكامل من الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي البشري.

بمجرد إتقانها ، يمكن للمرء أن يولد كميات كبيرة من خلايا iPS في ثلاثة أسابيع ، لذا فإن التدريب العملي سيكون أقل من ثلاث ساعات. لقد طورنا نظاما ناقلا عرضيا بسيطا لإعادة برمجة خلايا الدم بكفاءة. نعتقد أنه يمكن اعتماد هذا النظام الميسور التكلفة بسهولة ، لا سيما في المختبرات الصغيرة ذات الموارد المحدودة.

لا تنس أن العمل بدم الإنسان والبلازما يمكن أن يكون خطيرا ، ويجب اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء القفازات ومعاطف المختبر أثناء تنفيذ هذا الإجراء.