تحليل البروتينات ملزم كاب في خلايا الإنسان تتعرض لظروف الأوكسجين فسيولوجية
ديسمبر 28, 2016
هنا ، نقدم بروتوكولات زراعة الخلايا البشرية لتحليل عوامل بدء الترجمة التي تربط غطاء 5 'من mRNA أثناء ظروف الأكسجين الفسيولوجية. تستخدم هذه الطريقة نظيرا m7GTP مرتبطا ب Agarose وهي مناسبة للتحقيق في عوامل ربط الغطاء وشركائها المتفاعلين.
الهدف العام من هذه التجربة هو التقاط البروتينات المرتبطة بالغطاء في ظروف انخفاض الأكسجين. تستخدم هذه الطريقة تناظرية من الأغاروز المرتبط بسبعة قبعة ميثيل غوانوزين للتحقيق في عوامل ربط الغطاء وشركائها المتفاعلين. ستساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال تخليق البروتين مثل تحديد العوامل الجديدة المنظمة للأكسجين المشاركة في الترجمة المعتمدة على الغطاء.
الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن الخلايا يتم الاحتفاظ بها في محطة عمل نقص الأكسجة حتى نقطة التحلل. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى علاج السرطان لأن الخلايا السرطانية داخل الورم تتعرض لمستويات منخفضة جدا من الأكسجين ويلعب التحكم الانتقالي دورا رئيسيا في تطور الورم. خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما قرأنا منشورا حديثا من زملاء كورونا أفاد بأن أكسجة الأنسجة أقرب في الواقع إلى ما نسميه نقص الأكسجة بدلا من القاعدة المعيارية التي تزرع فيها الخلايا بشكل روتيني.
ابدأ هذا الإجراء سيؤدي إلى زراعة الخلايا كما هو موضح في بروتوكول النص. بعد عد الخلايا باستخدام مقياس الدم ، قم بتغذية 150 ملم من الأطباق المستنبتة التي تحتوي على 15 مل من الوسط الكامل للحصول على كثافة خلية تتراوح من 2500 إلى 5000 خلية لكل سنتيمتر مربع. استخدم طبقين مقاس 150 ملم لكل اختبار ربط للغطاء.
ضع أطباق الاستزراع المصنفة في الحاضنة عند 37 درجة مئوية وجو من ثاني أكسيد الكربون بنسبة خمسة بالمائة. بعد احتضان الخلايا لمدة 24 ساعة على الأقل ، ضع الخلايا في محطة عمل نقص الأكسجة للوقت المطلوب. ثم اضبط محطة العمل على الفسخية المناسبة.
قم بتسخين محلول ملحي مخزن من الفوسفات X مسبقا ، أو PBS ، والتربسين في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. Aliquot 980 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل في أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 ميكرولتر لكل مقايسة ربط الغطاء التي يتم إجراؤها. 10 ميكرولتر من كوكتيل مثبط البروتياز 100X و 10 ميكرولتر من 4-بنزين سلفونيل فلوريد هيدروكلوريد إلى 980 ميكرولتر من محلول التحلل على الجليد.
تخلص من الوسائط من كل طبق 150 ملم في حاوية نفايات داخل محطة عمل نقص الأكسجة. ثم اغسل الخلايا بثلاثة إلى أربعة ملليلتر من واحد X PBS دافئ وتخلص من السائل. أضف ملليلترا واحدا من التربسين الدافئ بنسبة 05 في المائة EDTA إلى كل طبق واترك الأطباق لمدة دقيقتين أو حتى تختفي الخلايا من الالتصاق بالطبق.
باستخدام ماصة ، انقل خلايا لوحة واحدة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر. كرر حسب الحاجة بحيث يتم نقل كل لوحة من الخلايا إلى أنبوب منفصل للطرد المركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر. الطرد المركزي أنابيب الطرد المركزي الدقيقة عند 6000 مرة جم لمدة 90 ثانية لحبيبات الخلايا.
بعد الطرد المركزي ، قم بشفط التربسين باستخدام ماصة دون إزعاج الحبيبات. اغسل الخلايا بواحد دافئ X PBS عن طريق سحب 200 ميكرولتر من PBS برفق في الأنبوب الموجود فوق الحبيبات مباشرة. ثم استنشق PBS دون إزعاج الحبيبات.
بعد ذلك ، قم بتعبئة 500 ميكرولتر من محلول المخزن المؤقت للتحلل المحضر بسعة ملليلتر واحد على الحبيبات الخلوية الأولى. أعد تعليق الحبيبات تماما عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل. اجمع بين الخلايا المعاد تعليقها مع حبيبات الخلية الثانية وأعد تعليق الحبيبات الثانية عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل.
كرر هذه العملية حتى يتم دمج جميع الكريات وإعادة تعليقها لكل عينة. بعد ذلك ، امزج المحللة مع 500 ميكرولتر المتبقية من محلول التحلل في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 لتر. قم بإزالة العينات من محطة عمل نقص الأكسجة.
قم بتحلل الخلايا باستخدام التحريك اللطيف عن طريق تدوير العينات عند أربع درجات مئوية لمدة 1.5 إلى ساعتين. بعد الحضانة ، قم بالطرد المركزي للخلايا المحللة عند 1200 مرة جم لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية لإزالة الحطام الخلوي. انقل المحللة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 مل وتخلص من الحبيبات.
احتفظ بجزء من المادة الطافية لاستخدامها كتحكم في مدخلات محللة الخلية الكاملة لتحليل اللطخة الغربية. للتحضير لمقايسة ربط الغطاء ، استخدم المقصا لإزالة طرف الماصة لتسهيل جمع ملاط الخرزة. لكل عينة ، انقل 50 ميكرولترا من ملاط التحكم في حبة الاغاروز الفارغة و 50 ميكرولترا من ملاط الخرز المرتبط ب m7GTP agarose C10 لفصل أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل.
بعد ذلك ، قم بتكسير الخرزات عن طريق الطرد المركزي للملاط عند 500 مرة جم لمدة 30 ثانية. قم بإزالة المادة الطافية بعناية وأعد تعليق الخرزات في 500 ميكرولتر من TBS. بعد تكرار هذه الخطوات ، قم بتكسير الخرزات بمعدل 500 مرة جم لمدة 30 ثانية وقم بإزالة المادة الطافية.
بعد ذلك ، انقل المادة الطافية التي تحتوي على المحللة إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 مل الذي يحتوي على حبات الاغاروز الفارغة. احتضن لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية مع تحريك لطيف. بعد 10 دقائق ، قم بتكسير حبات الاغاروز الفارغة عن طريق الطرد المركزي عند 500 مرة جم لمدة 30 ثانية.
بعد الطرد المركزي ، انقل المحللة التي لا ترتبط بالخرز إلى أنبوب الطرد المركزي الصغير سعة 1.5 مل الذي يحتوي على حبات m7GTP agarose C10. اغسل حبات الاغاروز الفارغة عن طريق إعادة تعليق الخرزات في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل ، وتكوير الخرزات عن طريق الطرد المركزي عند 500 مرة جم لمدة 30 ثانية ، والتخلص من المادة الطافية. كرر هذا أربع مرات ليصبح المجموع خمس غسلات.
أعد تعليق حبات الاغاروز الفارغة في مخزن مؤقت واحد لعينة X SDS-PAGE. واغلي الخرزات لمدة 90 ثانية عند 95 درجة مئوية. قم بتخزين العينة عند 20 درجة مئوية لتحليل اللطخة الغربية في المستقبل لمراقبة الطقس الذي يرتبط البروتين محل الاهتمام بشكل غير محدد بالخرزة.
احتضن المحللة مع حبيبات m7GTP agarose C10 المرتبطة بتحريض لطيف لمدة ساعة واحدة عند أربع درجات مئوية لالتقاط البروتينات المرتبطة بالغطاء. بعد التحريض ، قم بتكسير حبات m7GTP المرتبطة ب agarose C10 عن طريق الطرد المركزي عند 500 مرة جم لمدة 30 ثانية. بعد التخلص من المادة الطافية ، اغسل حبات m7GTP agarose C10 المرتبطة كما كان من قبل.
أعد تعليق الخرزات في 600 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل وأضف GTP إلى التركيز النهائي البالغ ملليمول. احتضن حبات m7GTP المرتبطة ب agarose C10 بالإضافة إلى مللي مولار GTP مع تحريك لطيف لمدة ساعة واحدة عند أربع درجات مئوية. سيؤدي ذلك إلى فصل البروتينات التي تتفاعل بشكل غير محدد مع m7GTP.
قم بتحبيب حبات m7GTP المرتبطة ب agarose C10 عن طريق الطرد المركزي عند 500 مرة جم لمدة 30 ثانية. انقل المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 ملليلتر ، وأضف 200 ميكرولتر من أربعة عازلة عينة X SDS-PAGE. بعد غسل الخرزات كما كان من قبل ، أعد تعليق الخرزات في مخزن مؤقت واحد لعينة X SDS-PAGE واغليها على حرارة 95 درجة مئوية لمدة 90 ثانية.
تظهر هنا بقع غربية تمثيلية لتنقية تقارب m7GTP نموذجية لبروتينين رئيسيين مرتبطين بالغطاء استجابة لتقلبات الأكسجين في الخلايا الظهارية للنبيبات الكلوية القريبة للإنسان الأولية. تعرضت محللات الخلية لثمانية بالمائة أو خمسة بالمائة أو ثلاثة بالمائة أو واحد بالمائة من الأكسجين لمدة 24 ساعة. تشتمل الممرات على 10 في المائة من محللة الخلية بأكملها كمدخلات ، وغسلها GTP لقياس خصوصية m7GTP ، والبروتينات المرتبطة بخرز m7GTP بعد غسل GTP.
تم تحديد البيانات من ثلاث تجارب مستقلة على الأقل بواسطة الصورة J وتم التعبير عنها كوحدات كثافة نسبية بالنسبة إلى 10 في المائة من مدخلات محللة الخلية بأكملها. تشير النتائج إلى أن الخلايا البشرية المزروعة تحت الأكسجين الفسيولوجي تستخدم بروتينين مرتبطين بالغطاء لتجنيد mRNAs مميزة للترجمة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية التقاط البروتينات المرتبطة بالغطاء في ظروف الأكسجين المنخفض.
أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر إبقاء الخلايا في محطة عمل نقص الأكسجة حتى نقطة التحلل ، حيث يمكن للأكسجين أن يغير بسرعة الخصائص الكيميائية الحيوية لعوامل بدء الترجمة هذه. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل تجزئة متعدد الأطراف للإجابة على أسئلة إضافية مثل البروتينات المرتبطة بالغطاء التي ترتبط بالترجمة النشطة في ظل ظروف انخفاض الأكسجين.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة طريقة لتحليل عوامل بدء الترجمة التي ترتبط بقبعة 5' من mRNA في ظروف الأكسجين المنخفضة. باستخدام تناظرية قبعة m7 GTP المرتبطة بالأجاروز، تهدف هذه التقنية إلى تحديد عوامل منظم بالأكسجين جديدة تشارك في الترجمة المعتمدة على القبعة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الخلية
- تخليق البروتين
الخلفية
- تلعب البروتينات الرابطة للقبعة دورًا حاسمًا في بدء الترجمة.
- غالبًا ما تتعرض الخلايا في الأورام لظروف نقص الأكسجة.
- فهم الترجمة في ظروف الأكسجين المنخفضة يمكن أن يفيد في علاج السرطان.
- تشير الدراسات الحديثة إلى أن أكسجة الأنسجة غالبًا ما تكون أقرب إلى نقص الأكسجة من الوضع الطبيعي للأكسجة.
هدف الدراسة
- التقاط البروتينات الرابطة للقبعة في ظروف الأكسجين المنخفضة.
- للتحقيق في تفاعل العوامل الرابطة للقبعة وشركائها.
- لتحديد عوامل جديدة تنظم الترجمة في ظروف نقص الأكسجة.
الطرق المستخدمة
- استخدام تناظرية قبعة m7 GTP المرتبطة بالأجاروز.
- زراعة الخلايا في محطة عمل نقص الأكسجة حتى التحلل.
- تحليل تفاعلات البروتينات تحت مستويات أكسجين خاضعة للرقابة.
- تطبيق الطريقة لدراسة التحكم في الترجمة في الخلايا السرطانية.
النتائج الرئيسية
- التقاط ناجح للبروتين الرابطة للقبعة في ظروف نقص الأكسجة.
- تحديد عوامل منظم بالأكسجين جديدة تشارك في الترجمة.
- رؤى حول دور التحكم في الترجمة في تطور الورم.
- التحقق من فعالية الطريقة في دراسة تخليق البروتين.
الاستنتاجات
- توفر هذه الطريقة نهجًا جديدًا لدراسة عوامل بدء الترجمة.
- قد تكون النتائج لها آثار على فهم بيولوجيا السرطان.
- قد يؤدي البحث الإضافي إلى تعزيز الاستراتيجيات العلاجية المستهدفة للأورام منخفضة الأكسجة.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Understanding oxygen-dependent regulation of translation initiation is critical for de-risking oncology targets, as tumor microenvironments exhibit physiological oxygen levels that alter cap-dependent protein synthesis. This method enables identification of oxygen-sensitive cap-binding proteins, supporting mechanistic validation of translation factors in disease-relevant systems. By preserving native oxygen conditions during sample preparation, the approach enhances predictive confidence in target validation and assay development for hypoxic disease models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating cap-binding proteins under physioxia conditions that mimic human tissue oxygenation.
- Operational Value: Provides a reproducible workflow for validating oxygen-regulated translation factors as potential drug targets in cancer biology.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative binding data for cap-dependent translation factors across oxygen gradients, enabling assay standardization for target engagement studies.
- Operational Value: Supports development of oxygen-controlled biochemical assays to screen modulators of translation initiation in physiologically relevant conditions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates mechanistic de-risking by linking oxygen-sensitive cap-binding proteins to translational control in disease-relevant primary human cells.
- Operational Value: Enables continuity from discovery to preclinical validation by maintaining hypoxic conditions throughout sample processing, reducing artifactual target modulation.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing oxygen-regulated biochemical readouts that inform target selection and lead identification in oncology programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of oxygen-dependent translation initiation by capturing cap-binding proteins under controlled physioxia.
- Screening: Enables assay readiness through standardized capture and elution of m7GTP-binding proteins under low oxygen conditions.
- Analytics: Generates quantitative western blot outputs to compare cap-binding protein abundance across oxygen levels, aiding comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by using primary human renal proximal tubule epithelial cells as a disease-relevant system for oxygen-regulated translation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying oxygen-sensitive RNA-binding proteins across multiple target classes beyond translation factors.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in oxygen-sensitive translation pathways.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization by requiring hypoxia workstation use for cell culture, lysis, and biochemical steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early de-risking of targets whose activity is confounded by standard normoxic culture conditions.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets in hypoxic disease areas through oxygen-controlled biochemical validation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in hypoxic cell culture and biochemical assay execution within controlled atmosphere workstations.
- Dependent on access to hypoxia workstations for maintaining physioxia during cell handling and sample preparation.
- Necessitates standardization of oxygen levels and equilibration times across laboratories for reproducible cap-binding protein recovery.
- Involves adaptation considerations when applying the method to non-adherent or primary cell types with varying oxygen sensitivity.
- Limited by potential loss of cap interactors that require second-base interactions or m7GTP hydrolysis, as noted in the protocol.
