من النوع البري منع PCR جنبا إلى جنب مع التسلسل المباشر كوسيلة الحساسة بشدة للكشف عن التردد المنخفض الجسدية الطفرات

الهدف العام من هذا الإجراء هو اكتشاف الطفرات الجسدية منخفضة التردد في مجموعة متنوعة من أنواع العينات. يمكن أن تساعد هذه المنهجية في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في اختبار الطفرات الجسدية من خلال تسهيل اكتشاف الطفرات منخفضة التردد للغاية. سنبحث هنا عن طفرات في جين myd88 في عينات نخاع العظام.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها توفر معلومات دقيقة وحساسة للغاية حول وجود طفرات جسدية ، حتى مع وجود عدد قليل جدا من الخلايا الورمية. تم تطوير مقايسة التسلسل القائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل من النوع البري لتضخيم جزء من exon five في جين myd88 ، مما يضمن تغطية النقطة الساخنة L265. تم تصميم البادئات الأمامية والخلفية بتسلسل M13 بخمسة رئيسيات للسماح بالركوع في بادئات التسلسل المجانية.

صمم قليل النوكليوتيد المانع بحيث يكون طوله حوالي 10 إلى 15 قاعدة ومكملا لقالب النوع البري حيث يكون التخصيب المتحور مطلوبا. سيؤدي أوليغو الأقصر إلى تحسين التمييز في عدم التطابق. لتحقيق خصوصية عالية الهدف ، من المهم عدم استخدام الكثير من النيوكليوتيدات الحائجة ، لأن هذا سيؤدي إلى قليل النوكليوتيدات اللزجة للغاية.

لتصميم قليل النوكليوتيدات الحظر ، ابدأ بالانتقال إلى موقع Oligo Tools. حدد أداة التنبؤ Oligo TM. ستفتح نافذة جديدة.

الصق تسلسل قالب النوع البري المراد حظره في مربع تسلسل oligo. أضف علامة زائد أمام قواعد المانع لتمييزها. انقر فوق زر الحساب لتحديد TM التقريبي لهجين مانع الحمض النووي.

ستظهر درجات حرارة الانصهار المحسوبة في المربعات أدناه. صمم oligo المانع بحيث تكون درجة حرارة انصهار 10 إلى 15 درجة مئوية أعلى من درجة حرارة التمدد أثناء التدوير الحراري. هنا ، درجة حرارة التمديد 72 درجة مئوية.

لضبط درجة حرارة الانصهار ، أضف قواعد الحظر أو إزالتها أو استبدلها. تجنب الامتدادات الطويلة من ثلاثة إلى أربعة قواعد C أو G التي تسد. بعد ذلك ، لتجنب تكوين الهيكل الثانوي أو التضليل الذاتي ، ارجع إلى الشاشة الرئيسية لموقع Oligo Tools وحدد أداة Oligo Optimizer.

سيتم فتح نافذة جديدة. الصق تسلسل قالب النوع الجامح المراد حظره في المربع. أضف علامة زائد للإشارة إلى قواعد الحظر.

حدد المربعين للهيكل الثانوي والذات فقط واضغط على زر التحليل لرؤية درجات التهجين والبنية الثانوية. تمثل هذه الدرجات تقديرات تقريبية جدا لدرجات حرارة انصهار الثنائيات الذاتية والهياكل الثانوية على التوالي. الدرجات المنخفضة هي الأمثل ويمكن تحقيقها عن طريق الحد من إقران مانع الحاظر.

قم بإزالة أو إعادة وضع النيوكليوتيدات الممانعة من أجل تحقيق درجات أقل. يحقق نوكليوتيد oligo المانع المحسن ل myd88 الموضح هنا توازنا بين درجة حرارة الانصهار الهجين لمانع الحمض النووي والتهجين المنخفض بما فيه الكفاية ودرجات الهيكل الثانوي. تم تصميمه لتغطية الأحماض الأمينية Q262 إلى I266 ، ويتميز بثلاثة DT مقلوبة رئيسية لتثبيط كل من التمدد بواسطة بوليميراز الحمض النووي والتحلل بثلاثة نوكلياز خارجي رئيسي.

بمجرد تصميم البادئات ، قم بإعداد تفاعل البوليميراز المتسلسل من النوع البري وإجراء التدوير الحراري كما هو موضح في المستند المصاحب. قم بإزالة الخرزات المغناطيسية من التخزين عند أربع درجات مئوية ووضعها في درجة حرارة الغرفة. انقل 10 ميكرولترات من منتج PCR إلى لوحة PCR جديدة.

بتدوير الخرزات المغناطيسية بقوة لإعادة تعليق الجسيمات المغناطيسية بالكامل ثم إضافة 18 ميكرولترا من الخرزات المغناطيسية إلى كل بئر على اللوحة الجديدة. الماصة لأعلى ولأسفل 10 مرات للخلط. ثم احتضان الطبق في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.

بعد الحضانة ، ضع لوحة PCR على لوحة المغناطيس الجانبية لمدة دقيقتين لفصل الخرزات عن المحلول. استخدم ماصة متعددة القنوات لشفط المادة الطافية. احرص على تجنب حبيبات الخرزة.

بعد ذلك ، قم بتوزيع 150 ميكرولترا من الإيثانول بنسبة 70٪ في كل بئر واحتضان اللوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 ثانية على الأقل. ثم استنشق الإيثانول بماصة متعددة القنوات وتخلص من الأطراف. كرر إجراء الغسيل هذا مرة أخرى.

باستخدام ماصة متعددة القنوات سعة 20 ميكرولتر ، قم بشفط الإيثانول المتبقي من كل بئر وتخلص من الأطراف. بعد السماح بحوالي 10 دقائق حتى تجف آبار الصفيحة ، قم بإزالتها من المغناطيس وأضف 40 ميكرولترا من الماء الخالي من النوكلياز إلى كل بئر. الماصة لأعلى ولأسفل 15 مرة للخلط.

ثم احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين. بعد الحضانة ، ضع لوحة PCR مرة أخرى على لوحة المغناطيس لمدة دقيقة واحدة لفصل الخرزات عن المحلول. انقل 35 ميكرولترا من المنتج المنقى إلى لوحة PCR جديدة ، وقم بإجراء تسلسل ثنائي الاتجاه كما هو موضح في المستند المصاحب.

بمجرد إجراء التسلسل ثنائي الاتجاه لتنقية منتجات التسلسل ، قم بإعداد محلول جديد في 25 من ثلاثة أسيتات الصوديوم المولار عند درجة الحموضة 5.2 و 100٪ الإيثانول. قم أيضا بإعداد محلول جديد بنسبة 70٪ من الإيثانول. أضف إلى كل بئر من ألواح التسلسل الأمامية والعكسية 30 ميكرولترا من أسيتات الصوديوم في 100٪ من الإيثانول والماصة لأعلى ولأسفل خمس مرات للخلط.

ثم أعد إغلاق اللوحة ، واحتضن في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. بعد مرور 20 دقيقة ، قم بالطرد المركزي للوحة عند 2 ، 250 مرة G لمدة 15 دقيقة. بعد الدوران ، قم بإزالة مانع التسرب ، واقلب اللوحة مرة واحدة فوق حاوية النفايات.

إذا تم قلب اللوحة عدة مرات ، فقد تتحلل الكريات من قيعان الآبار. ضع اللوحة المقلوبة على منشفة ورقية نظيفة ، وجهاز طرد مركزي عند 150 مرة جم لمدة دقيقة واحدة. بعد ذلك ، أضف 150 ميكرولترا من الإيثانول بنسبة 70٪ إلى كل بئر وأعد إغلاق اللوحة.

تدور في 2 ، 250 مرة جم لمدة خمس دقائق. ثم كرر عملية إزالة مانع تسرب اللوحة وعكس اللوحة. إذا لم تكن الآبار جافة تماما ، اتركها تجف في الهواء في درجة حرارة الغرفة.

تأكد من حماية العينات من الضوء. بمجرد أن تجف الآبار تماما ، أضف 10 ميكرولترات من الفورماميد إلى كل بئر ، وقم بالماصة لأعلى ولأسفل 10 مرات للخلط. أعد إغلاق اللوحة.

قم بتغيير طبيعة المستخدم باستخدام جهاز تدوير حراري عند 95 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق متبوعا بأربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. بعد تغيير الطبيعة ، استبدل مانع تسرب اللوحة بحاجز وتسلسل على منصة تسلسل وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. باستخدام برنامج تحليل التسلسل ، قم بتصور الآثار ، وقم بمحاذاة التسلسلات مع التسلسلات المرجعية المناسبة.

قم بمحاذاة myd88 مع NM002468 التسلسل المرجعي NCBI. خضع الحمض النووي الجيني للمرضى الذين يعانون من طفرات وبدونها لتفاعل البوليميراز المتسلسل التقليدي والبري ثم تم تسلسل منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل الناتجة. كما يتضح هنا ، تم إثراء الأليل المتحور عند إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل من النوع البري ، ولم تظهر الإيجابيات الكاذبة في الحمض النووي من النوع البري.

غالبا ما يظهر انخفاض مميز في شدة الإشارة كما هو موضح هنا إذا تم استخدام تركيز عال جدا من الحاجز ، أو إذا فشل تنقية ما بعد تفاعل البوليميراز المتسلسل في إزالة الحاجز قبل التسلسل ثنائي الاتجاه. يحدث هذا عندما يتم إجراء التنقية الأنزيمية بدلا من تنقية الخرزة المغناطيسية. أي اختبار قائم على تفاعل البوليميراز المتسلسل يثري الأليلات الطافرة سيكتشف القطع الأثرية منخفضة التردد.

تظهر هذه الآثار زيادة في القطع الأثرية لتسلسل CG ، بالنسبة إلى القطع الأثرية TA في أنسجة FFPE عندما يتم إزالة السيتوزين أو السيتوزين الميثيلي عن طريق التثبيت الرسمي لليوراسيل أو الثيامين على التوالي. يمكن ل Uracil DNA glycosylase أو UDG استئصال اليوراسيل قبل حجب تفاعل البوليميراز المتسلسل من النوع البري ، مما يساعد على تقليل القطع الأثرية للتسلسل. ومع ذلك ، فإن الثيامين الناتج عن خمسة ميثيل سيتوزين منزوع الأمين والذي يحدث بشكل متكرر في جزر CPG لا يمكن استئصاله بواسطة UDG.

يساعد تقليل تركيز الحاجز المستخدم في تفاعل البوليميراز المتسلسل من النوع البري في تقليل حدوث القطع الأثرية المتسلسلة التي لا يتم علاجها عن طريق علاج UDG. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية اختبار الطفرات الجسدية بدرجة عالية من الدقة والحساسية ، باستخدام تقنية حجب النوع البري. يمكن تطبيق مبدأ هذه التقنية للكشف عن الطفرات في مجموعات صغيرة من الخلايا.

لذلك ، فإن له فائدة في الكشف عن الحد الأدنى من المرض المتبقي ، ومراقبة المرضى ، والتنبؤ بالانتكاس المبكر لدى المرضى الذين يعانون من الأورام المختلفة.