الكشف عن نسخة عدد التعديلات عن طريق التسلسل خلية واحدة

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد تغييرات رقم نسخ الحمض النووي على نطاق واسع في الخلايا المفردة. من أجل تصنيف عدم التجانس الجيني في مجموعات الخلايا ، من الضروري تحديد التغيرات الجينومية بدقة الخلية الواحدة. تقليديا ، تم تحقيق ذلك باستخدام الأساليب الخلوية ، ومع ذلك ، كانت هذه الأساليب محدودة في حساسيتها وخصوصيتها.

يمكن أن يكتشف التسلسل أحادي الخلية مجموعة متنوعة من التغيرات الجينومية ، مع تحسين الحساسية والنوعية على الأساليب السابقة ، ولكن فقط عند تنفيذها بعناية. هنا ، نصف كيفية استخدام تسلسل الخلية المفردة للكشف بشكل موثوق عن تغييرات عدد النسخ على نطاق megabase في الخلايا المفردة. لتجميع الشفاط الصغير ، ابدأ بإزالة الطرف البلاستيكي الشفاف من مجموعة أنبوب الشفاط وأدخل الطرف الضيق في أحد طرفي أنبوب PVC بطول قدم واحد بقطر داخلي 3/16 بوصة.

أدخل مخرج مرشح حقنة 0.2 ميكرومتر في الطرف الآخر من الأنابيب البلاستيكية التي يبلغ طولها قدما واحدة بقطر داخلي 3/16 بوصة. ثم أدخل مدخل مرشح الحقنة 0.2 ميكرومتر في أحد طرفي أنبوب PVC بطول ستة بوصات بقطر داخلي 5/16 بوصة. اكسر ماصة مصلية بلاستيكية سعة خمسة ملليلتر عند تخرج مليلتر واحد وأدخل الطرف المكسور في الطرف المفتوح للأنبوب PVC بقطر داخلي 5/16 بوصة.

بعد ذلك ، أدخل مخرج الماصة المصلية البلاستيكية سعة خمسة ملليلتر في الطرف المرن لمجموعة أنبوب الشفاط ، ثم استخدم أنبوبا بلاستيكيا معقما لتغطية لسان حال المجموعة الحمراء لمجموعة الأنبوب للتخزين. ارسم أنبوبا شعريا زجاجيا بقطر داخلي يتراوح بين 10 و 30 ميكرومتر عن طريق وضع منتصف الأنبوب بالقرب من اللهب وتطبيق الشد على طرفي الأنبوب. قسم الأنبوب المسحوب إلى نصفين لإنشاء إبرتين محتملتين للشفاطة.

كرر هذه الخطوة بعدة أنابيب للتأكد من تحضير إبر كافية بقطر داخلي مناسب لالتقاط الخلايا المفردة. لتحضير خلايا الالتصاق ، مثل خطوط خلايا الخلايا الليفية البشرية ، حصاد الخلايا عن طريق التربسين ، ونقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي يحتوي على الوسط المناسب. قم بإعداد غطاء لتضخيم الجينوم بالكامل باستخدام 10٪ مبيض للرش على سطح الغطاء وصناديق أطراف الماصة وأطراف الماصة.

ثم استخدم منشفة ورقية لمسحها جميعا قبل تكرار الغسيل بنسبة 70٪ من الإيثانول. أضف ثمانية ميكرولترات من الماء من مجموعة تضخيم الجينوم الكامل ، أو WGA ، إلى الآبار الفردية إلى لوحة PCR المكونة من 96 بئرا. ثم قم بتغطية لوحة PCR المكونة من 96 بئرا بغطاء من لوحة زراعة الأنسجة المكونة من 96 بئرا ، وضع اللوحة على الجليد.

بعد ذلك ، أضف 1000 خلية إلى 10 ملليلتر من المتوسط أو PBS في طبق بتري بطول 15 سم وضع الطبق على الجليد لمنع الخلايا من الالتصاق بالطبق. بعد ذلك ، بينما لا تزال على الجليد ، انقل الخلايا الموجودة في طبق بتري ولوحة PCR المكونة من 96 بئرا إلى مجهر ضوئي بهدف 10X. قم بزيادة فتحة إبرة الشفاط عن طريق النقر برفق على الطرف الممتد للإبرة على سطح صلب حتى ينكسر الطرف.

ثم أدخل الطرف العريض للإبرة في الطرف الشفاف للشفاط الصغير. بعد ذلك ، ضع طبق بتري الذي يحتوي على خلايا على مرحلة المجهر. أدخل لسان حال الشفاط الأحمر في الفم.

بعد ذلك ، أثناء استخدام أحدهما كان يجب تحريك إبرة الشفاط ، واليد الأخرى لتحريك طبق بتري ، وتحديد الخلايا المفردة المراد تسلسلها. باستخدام شفط الفم ، ارسم خلية واحدة في إبرة الشفاط مع ما يقرب من ميكرولتر إلى اثنين من الميكرولتر من الوسط أو PBS. انقل الخلية إلى ثمانية ميكرولترات من الماء في بئر واحد من لوحة PCR المكونة من 96 بئرا.

تعتمد جودة وفائدة بيانات تسلسل الخلية المفردة على حالة كل خلية وجينومها ، لذلك ، توخي الحذر أثناء تحضير الخلية والشفط الدقيق لعزل الخلايا القابلة للحياة وغير الخلايا المبرمجة. بعد شفط كل خلية ونقلها إلى بئر من لوحة PCR ، ضع علامة على البئر الذي تلقى خلية. كرر هذا للعدد المطلوب من الخلايا.

في غضون ذلك ، قم بإذابة 10X Single-Cell Lysis Fragmentation Buffer من مجموعة تضخيم الجينوم بأكمله. لمنع التلوث أثناء تضخيم الجينوم الكامل ، أضف جميع الكواشف داخل غطاء زراعة الأنسجة. استخدم أطراف الماصة مع المرشحات، وقم بتغيير طرف الماصة بين الآبار.

لكل مجموعة تصل إلى 32 خلية ، اجمع بين 32 ميكرولترا من 10X Single-Cell Lysis and Fragmentation Buffer و 2 ميكرولتر من محلول Proteinase K في أنبوب طرد مركزي دقيق ، ثم قم بتدوير الأنبوب لخلط المحتويات. أضف ميكرولتر واحد من المحلول إلى كل بئر وقم بالماصة لأعلى ولأسفل للخلط. قم بتغطية اللوحة واستخدم غشاء بلاستيكي لإغلاق جميع الآبار.

ثم قم بالطرد المركزي للفترة وجيزة في لوحة صغيرة دورا. بعد ذلك ، قم بتشغيل اللوحة من خلال جهاز التحكم الحراري باستخدام البرنامج التالي. ثم قم بتبريد الطبق على الجليد ، وقم بالطرد المركزي لفترة وجيزة.

لإعداد حل عازل لإعداد مكتبة العمل من مجموعة تضخيم الجينوم الكامل ، لكل خلية ، اجمع بين ميكرولترين من 1X Single Cell Library Preparation Buffer ، وميكرولتر واحد من حل تثبيت المكتبة. يعد التحلل الكافي للخلايا وتجزئة الجينوم الكاملة أمرا بالغ الأهمية لتقليل التحيز أثناء تضخيم الجينوم الكامل وضمان إعداد مكتبات تسلسل عالية الجودة. على هذا النحو ، احرص على تنفيذ هذه الخطوات تماما كما هو مكتوب.

قم بإزالة الفيلم البلاستيكي من الطبق وأضف ثلاثة ميكرولترات من المحلول إلى كل بئر. قم بتقطيع محتويات البئر لأعلى ولأسفل للخلط ، ثم استبدل الفيلم البلاستيكي. بعد تدوير اللوحة لفترة وجيزة ، احتضن الخلايا عند 95 درجة مئوية لمدة دقيقتين ، ثم قم بتبريد اللوحة على الجليد ، وقم بالطرد المركزي للفترة وجيزة مرة أخرى.

الآن ، قم بإزالة الفيلم البلاستيكي ، وأضف ميكرولتر واحد من إنزيم تحضير المكتبة إلى كل بئر ، وقم بسحب محتويات البئر لأعلى ولأسفل للخلط ، ثم استبدل الفيلم البلاستيكي. بعد تدوير اللوحة لفترة وجيزة ، ضعها في الدراجة الحرارية وقم بتشغيل البرنامج التالي. بعد تبريد اللوحة وإعطاء دوران قصير ، قم بإعداد مزيج تضخيم عملي من مجموعة تضخيم الجينوم الكامل عن طريق الجمع بين 48.5 ميكرولتر من الماء ، و 7.5 ميكرولتر من مزيج التضخيم الرئيسي 10X ، و 5 ميكرولترات من بوليميراز WGA DNA ، لكل خلية.

احتفظ بمزيج العمل على الثلج. قم بإزالة الفيلم البلاستيكي من اللوحة. أضف 61 ميكرولترا من مزيج تضخيم العمل إلى كل بئر ، وقم بتقطيع محتويات كل بئر لأعلى ولأسفل للخلط ، ثم استبدل الفيلم البلاستيكي.

بإيجاز ، قم بالطرد المركزي للوحة والدورة الحرارية على النحو التالي. تسلسل العينات وإجراء تحليل البيانات وفقا لبروتوكول النص. كما هو موضح في هذا الشكل ، إذا نجح تضخيم الجينوم الكامل ، فستظهر العينة على شكل مسحة على هلام الاغاروز.

تشير اللطاخة الخافتة أو الغائبة إلى تفاعل تضخيم فاشل ويجب عدم تسلسل العينة. كما هو موضح هنا ، تم إجراء تحليل أحجام الشظايا باستخدام الرحلان الكهربائي الشعري على محلل الشظايا. سيكون للمكتبات المعدة بنجاح توزيع متساو إلى حد ما لأحجام الأجزاء من 150 إلى 900 زوج أساسي.

سيؤدي فشل إعداد المكتبة إلى توزيع حجم جزء منحرف ويجب عدم تسلسل هذه المكتبات. باستخدام نموذج ماركوف المخفي والتجزئة الثنائية الدائرية ، تم تحليل جينوم كل خلية إلى أجزاء من رقم النسخة المقدر. يوضح هذا الجدول النتائج المتداخلة من خلية واحدة ويكشف عن كسب على الكروموسوم 10 من 67 إلى 130 ميجا بيس، وكسب على الكروموسوم 19 من 0 إلى 20 ميجا بيس.

ويجب إجراء العزل وتضخيم الجينوم الكامل للخلايا المفردة في يوم واحد. يمكن بعد ذلك إجراء إعداد مكتبات التسلسل ، وتسلسل الجينوم الكامل ، وتحليل البيانات وفقا لجدول زمني مرن. عندما يتم إجراء عزل الخلية وتضخيم الجينوم الكامل بشكل صحيح ، ويتم إجراء تحليل البيانات بدقة كما هو موضح ، يمكن اكتشاف تغييرات رقم النسخ التي تتجاوز خمس ميجا القواعد بحساسية وخصوصية عالية.

بينما يصف بروتوكولنا على وجه التحديد استخدام تسلسل الخلية المفردة للكشف عن تغييرات رقم النسخ ، يمكن تطبيق جوانب هذا البروتوكول ، مثل عزل الخلية المفردة وإعداد المكتبة ، لاكتشاف التغييرات الجينومية الأخرى.