البكتيريا المستروحة الخارجي غشاء الحويصلات: عزل وتحليل إمكاناتهم الموالية للالتهابات في الضامة

الهدف العام من هذه الدراسة هو تنقية حويصلات الغشاء الخارجي أو OMVs من الفيلقية الرئوية بطريقة موحدة وتحليل تأثيرها على تكاثر البكتيريا في البلاعم البشرية والفئران. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال أبحاث حويصلات الغشاء الخارجي. على سبيل المثال ، قد يساعد الإجراء الموحد لإعداد OMV في دراسة تأثيرها على التفاعل بين المضيف والممرض.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها ستوفر بروتوكولا موحدا لدراسة تأثير الفيلقية الرئوية OMVs على البلاعم البشرية أو الفئران وهذا سيحسن فهمنا لإمراضية الفيلقية الرئوية. خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما فكرنا في الإمكانات المحتملة المؤيدة للالتهابات ل OMVs وكيف يمكن أن يؤثر ذلك على مسار العدوى حيث يتم إطلاق OMVs بواسطة الفيلقية داخل الخلية المضيفة وخارج الخلية. سيتم عرض الإجراء من قبل كيرستين هوفمان ، فني من مختبري وأنالينا يونغ ، باحثة ما بعد الدكتوراه.

للبدء ، أثناء العمل في ظل ظروف معقمة ، انشر L.pneumophila سلالة الأساسية B على ألواح أجار BCYE واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاثة أيام. استخدم L.pneumophila من صفيحة ما قبل الزراعة لتلقيح 10 ملليلتر من وسائط YEB عند OD600 من 0.3 واحتضان البكتيريا عند 37 درجة مئوية على شاكر دوار لمدة ست ساعات. تحقق من نقاء المزرعة السائلة عن طريق نشر 100 ميكرولتر من المعلق على صفيحة أجار الدم.

احتضان صفيحة أجار الدم طوال الليل عند 37 درجة مئوية. أضف المزرعة السائلة المتبقية إلى 90 مل من وسط YEB الطازج واحتضن المزرعة على شاكر دوار حتى تصل إلى OD600 من 3.0 إلى 3.5. الطرد المركزي للاستزراع السائل عند 4 ، 000 جم لمدة 20 دقيقة لتكويب البكتيريا.

ثم انقل المادة الطافية إلى أنابيب الطرد المركزي الطازجة. تخلص من الكريات البكتيرية وقم بالطرد المركزي للعينات مرة أخرى قبل تكرار خطوة الطرد المركزي مرة أخرى. بعد ذلك ، قم بتصفية تعقيم المادة المطفية المتبقية مرتين.

ثم انقل المادة الطافية الخالية من البكتيريا إلى أنابيب الطرد المركزي الفائق وقم بتدوير العينات عند 100،000 جم في أربع درجات مئوية لمدة ثلاث ساعات. صب المادة الطافية وتخلص منها. ثم استخدم PBS المعقم لإعادة تعليق كريات OMV وتجميعها.

كرر خطوة الطرد المركزي الفائق لإزالة البروتينات الملوثة و LPS الحر. الآن ، تخلص من المادة الطافية وجفف أنبوب الطرد المركزي الفائق بقطعة قطن معقمة. أعد تعليق حبيبات OMV ب 500 ميكرولتر من PBS المعقم.

ثم ضع 20 ميكرولترا لكل من ألواح أجار الدم و BCYE أجار لاستبعاد التلوث البكتيري للحويصلة المحضرة. احتضان صفيحة أجار الدم طوال الليل ولوحة أجار BCYE لمدة ثلاثة أيام. استخدم اختبار BCYE وفقا لتعليمات الشركة المصنعة لتحديد كمية البروتين لتحضير OMV الذي تم الحصول عليه.

بعد تمييز خلايا THP-1 إلى ضامة وفقا لبروتوكول النص ، استخدم 500 ميكرولتر من الوسط الطازج لاستبدال وسط التمايز واحتضان الخلايا لمدة 24 ساعة أخرى عند 37 درجة مئوية. لعلاج THP-1 أو خلايا BMDM الفئران باستخدام OMVs ، قم بإذابة OMVs المعدة مسبقا وإضافة الكمية المناسبة إلى الخلايا. احتضان البلاعم باستخدام OMVs عند 37 درجة مئوية لمدة 20 ساعة على الأقل لإصابة خلايا THP-1 المعالجة مسبقا أو غير المعالجة بسلالة L.pneumophila الأساسية من النوع البري B أو خلايا BMDM الفئرانية مع طفرة تفتقر إلى السوط من هذه السلالة دون تغيير الوسط من الخلايا.

أضف البكتيريا في وزارة الداخلية 0.5 والتي تصل إلى واحد في 10 إلى L.pneumophila الخامس لكل بئر. احتضان الثقافات لمدة 24 و 48 ساعة على التوالي. لتحلل الخلايا ، أضف الصابونين بتركيز نهائي قدره 0.1٪ واحتضان الخلايا لمدة خمس دقائق.

ثم أعد تعليق البلاعم المحللة عن طريق سحب العينات ونقل التعليق إلى وعاء تفاعل. استخدم PBS معقم لإعداد التخفيفات التسلسلية لتعليق L.pneumophila. ثم قم بوضع 50 ميكرولترا من التخفيفات المطلوبة على ألواح BCYE أجار واحتضان الألواح لمدة ثلاثة أيام.

عد المستعمرات المشكلة بصريا بالعين وقم بإجراء العمليات الحسابية وفقا لبروتوكول النص. في هذه التجربة ، فحص الإمكانات المؤيدة للالتهابات ل L.pneumophila OMVs ، تستجيب خلايا THP-1 المتمايزة PMA بزيادة تعتمد على الوقت والجرعة في إفراز IL-8 و IL-6. هنا ، تم تحليل تأثير المستقبلات المختلفة الشبيهة بالحصيلة على التعرف على L.pneumophila OMV في BMDMs الفئران ذات الخلفيات الجينية المختلفة باستخدام مقايسة CXCL-1 ELISA.

تفرز BMDMs الفئران من الفئران البرية CXCL-1 بعد تحفيز OMV بينما تفرز BMDMs الفئران من TLR2 / 4 بالضربة القاضية المزدوجة بشكل أقل بكثير. لدراسة تأثير L.pneumophila OMVs على تكاثر البكتيريا في الضامة THP-1 ، تم تحضين الخلايا مسبقا باستخدام OMVs لمدة 20 ساعة ثم أصيبت بالإضافة إلى L.pneumophila. يقلل التحفيز المسبق للضامة المشتقة من THP-1 أولا من جرعة التكاثر البكتيري اعتمادا على 24 ساعة من الإصابة بينما يؤدي إلى مضاعفة عدد CFU في وقت لاحق.

كما هو موضح في هذه التجربة ، فإن التحفيز المسبق لكثافة جسم الفئران مع OMVs يؤدي إلى زيادة بمقدار عشرة أضعاف في عدد CFU في BMDM الفئران من البرية بينما لا تظهر ضربة قاضية TLR2 و TRIF / MyD88 هذه الزيادة في تكرار L.pneumophila بعد الحضانة المسبقة ل OMV. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر العمل في ظل ظروف معقمة والتحقق من التلوث البكتيري ل OMVs المنقاة. خلاف ذلك ، فإن تحليل المصب لا يعطي نتائج قاطعة.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل تحليل تتبع الجسيمات النانوية من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل طفرة الفيلقية التي تنتج أكثر أو أقل من OMVs أو للتحقيق في تأثير ظروف الإجهاد المختلفة على إفراز OMVs. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال أبحاث OMV لاستكشاف تأثير OMVs على تفاعلات المضيف ومسببات الأمراض في المختبر ثم في الجسم الحي. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تنقية OMVs وكيفية البدء في تحليل تأثيرها على الإصابة اللاحقة بالبلاعم.

يمكن بعد ذلك تطبيق هذا البروتوكول على البكتيريا سالبة الجرام المختلفة والخلية المضيفة الخاصة بها بعد تكييف أوقات الحضانة والنمو. لا تنس أن العمل مع الفيلقية الرئوية يمكن أن يكون معديا للغاية للبشر ، لذلك يجب دائما تنفيذ العمل تحت مقعد معقم أثناء التعامل مع الفيلقية وتنفيذ هذا الإجراء.