عزل ماوس بطانة الرحم طلائي واللحمية خلايا ل

تتمثل الأهداف العامة لهذا الإجراء في عزل واستزراع الخلايا الأولية الظهارية واللحمية لبطانة رحم الفأر، وذلك لغرض الاستزراع المشترك لدراسة عملية التقرن (decidualization) في المختبر. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال الطب التناسلي، مثل طبيعة إشارات التلقي المجاورة (paracrine signaling) بين الخلايا الظهارية واللحمية خلال عمليات هامة مثل التقرن وغزو الأرومة الغاذية (trophoblast invasion)، وكيفية تنظيم مسار هذه الإشارات. ويمكن استخدام هذه التقنيات لدراسة عملية التقرن في نظام استزراع مشترك للخلايا الظهارية واللحمية.

من خلال استخدام هذا النظام، يمكنك تقييم ما إذا كانت جزيئات الإشارة التي تفرزها إحدى الخليتين قادرة على التأثير في هذه العملية. وقبل استئصال الرحم، قم بإجراء فحص مسحة مهبلية للتحقق من مراحل الدورة لدى الحيوانات، وذلك لاختيار الفئران التي تمر بمرحلة الشبق فقط.

كما يتم تمييزها بوجود خلايا بشرة القرنية في غسول المهبل. بعد ذلك، استخدم الملقط والمقص لفتح بطن الحيوان في مرحلة الشبق الأولى، ثم أزح الأمعاء إلى الجانب لرؤية كلا قرني الرحم. أمسك أحد القرنين من الطرف الأكثر قاصية، أسفل قناة فالوب، وقم بتشريح نسيج الرحم من قناة فالوب باستخدام ملقط التشريح، وملقط Dumont رقم 5 لإزالة الأنسجة الدهنية والضامة.

بعد ذلك، يتم إزالة القرن عند الطرف القاصي، فوق جسم الرحم. وبعد إزالة قرني الرحم، يوضعان في طبق بتري بقطر 35 ملم يحتوي على 3 مل من HBSS. وعند جمع كافة قرون الرحم، ينقل الطبق إلى المجهر المجسم (stereo microscope)، وتُستخدم الملاقط لإزالة أي أنسجة دهنية وضامة متبقية.

بعد ذلك، باستخدام ملقط Dumont رقم 5، وملقط تشريح، ومقص زنبركي صغير، يتم فتح قرني الرحم طولياً للكشف عن تجويفهما، ثم تُشطف الأنسجة في طبق بتري جديد يحتوي على محلول HBSS طازج. الآن، يتم نقل جميع القرون إلى أنبوب سعة 15 milliliter يحتوي على بانكرياتين وتريبسين. وتُحضن الأنسجة أفقياً لمدة 60 minutes عند درجة حرارة 4 °C وبسرعة 50 rpm على هزاز مداري.

في نهاية الساعة، انقل الأنبوب إلى طاولة العمل للحضن الأفقي لمدة 45 minute بدون رج، يليه حضن أفقي بدون رج لمدة 15 minute في حمام مائي بدرجة حرارة 37 degree celsius. في نهاية الحضن في الحمام المائي، قم بسكب السائل العلوي بعناية وانقل الأرحام إلى طبق بتري يحتوي على وسط خلايا بطانة الرحم الظهارية للفئران المبرد لمدة خمس دقائق لإيقاف نشاط التريبسين. بعد ذلك، انقل الأنسجة إلى أنبوب سعة 15 milliliter يحتوي على ثلاثة milliliter من HBSS المبرد، وقم برج الأنسجة باستخدام جهاز vortex لمدة 10 seconds لتحرير الصفائح الظهارية.

بعد ذلك، اشطف الرحم في طبق بتري جديد يحتوي على 3 mL من محلول HBSS الطازج، واجمع معلّقين إضافيين من الصفائح الظهارية في أنبوبين جديدين سعة 15 mL كما تم توضيحه للتو. بعد عملية الرج الثالثة للأنسجة، انقل الرحم إلى أنبوب مخروطي سعة 15 mL يحتوي على مزيج هضم الخلايا السدوية لبطانة رحم الفأر، وذلك للتحضين لمدة 30 دقيقة عند 37 °C وبسرعة 200 rpm. استعد الصفائح الظهارية عن طريق سحب معلقات الخلايا الثلاث برفق باستخدام الماصة عبر مصفاة نايلون بمسام 100 micron لإزالة حطام الأنسجة، ثم قم بطرد مركزي لمعلق الخلايا الناتج.

أعد تعليق الراسب في 12 milliliters من وسط زراعة الخلايا الظهارية لبطانة رحم الفأر مع الخلط جيداً، ثم اترك المحلول يترسب لمدة خمس دقائق لفصل الخلايا السدوية المتبقية لبطانة رحم الفأر بفعل الجاذبية. وفي نهاية عملية الترسيب، استخدم ماصة سعة خمسة milliliters لإزالة المليلترين العلويين من الطافي بعناية، ثم قم بطرد الخلايا المجموعة مركزياً. بعد ذلك، أعد تعليق الراسب الظهاري للفأر في الوسط الظهاري باستخدام الماصة بلطف.

ثم يتم توزيع الخلايا على شرائح غطاء مغطاة بالكولاجين بالكثافة المناسبة للتحليلات اللاحقة المخطط لها. بعد عزل الخلايا الظهارية، استمر في التعامل مع الخلايا السدوية وقم بإخراج أنبوب هضم الخلايا السدوية للفأر الذي يحتوي على الأرحام من الحاضنة. بعد تحضين لمدة 30 دقيقة، وكما تم توضيحه للتو، رج الأنبوب بلطف باليد لمدة 10 ثوانٍ، وانقل الأرحام إلى طبق بتري يحتوي على ثلاثة ملليلتر من HBSS بدرجة حرارة 4 °C.

اشطف الأنسجة جيداً، ثم أضف ثلاثة مليليتر من وسط الخلايا السدوية إلى أنبوب الهضم لإبطال نشاط التريبسين، وانقل الأرحام إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مليليتر يحتوي على ثلاثة مليليتر من وسط خلايا سدو بطانة الرحم للفئران الطازج. رُج أنبوب الأنسجة برفق لمدة 10 ثوانٍ. بعد ذلك، انقل الأرحام إلى طبق يحتوي على محلول HBSS بارد، ثم انقلها إلى أنبوب جديد سعة 15 مليليتر من وسط الخلايا السدوية.

بعد عملية شطف الأنسجة الثالثة ونقلها، يتم تحضين أنسجة الرحم في مزيج هضم خلايا سدى بطانة الرحم للفئران الطازج لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة 37 degree celsius. وفي نهاية عملية الهضم، يتم تمرير معلقات الخلايا من الأنابيب من واحد إلى ثلاثة وأنبوب التربسين عبر شبكة نايلون بمسامية 40 micron، ثم تُشطف الشبكة بخمسة مليلتر إضافية من وسط زراعة خلايا سدى بطانة الرحم للفئران. بعد ذلك، يتم تجميع الخلايا عن طريق الطرد المركزي.

ثم أعد تعليق الراسب في وسط زراعة خلايا سدى بطانة الرحم الفأرية الطازج من أجل زراعتها على شرائح غطاء مطلية بالبولي لايسين بكثافة مناسبة للتحاليل اللاحقة المخطط لها. ويمكن تقييم نقاء المزارع الخلوية الأولية من خلال الاختلافات في تعبير vimentin وcytokeratin، حيث تكون مستويات vimentin مرتفعة في خلايا سدى بطانة الرحم الفأرية، ومنخفضة في خلايا ظهارة بطانة الرحم الفأرية. بينما تكون مستويات cytokeratin مرتفعة في خلايا ظهارة بطانة الرحم الفأرية، ومنخفضة في خلايا سدى بطانة الرحم الفأرية.

يوضح الصبغ المزدوج لبروتين mentin والسايتوكيراتين (cytokeratin) بشكل أكبر تعبير mentin بواسطة الخلايا السدوية، بالإضافة إلى التعبير الحصري للسايتوكيراتين بواسطة الخلايا الظهارية. ويكشف تحفيز عملية التقرن (decidualization) في مستنبتات الخلايا السدوية عن طريق إضافة أحادي فوسفات الأدينوزين الحلقي (cyclic adenosine monophosphate) و MPA، أن مستويات MRNA للبرولاكتين تزداد بشكل كبير بعد خمسة أيام من المعالجة مقارنة بمستنبتات الخلايا السدوية الضابطة. ونظرًا لصعوبة رؤية الخلايا الظهارية في إدراجات استنبات الخلايا الجانبية، يمكن إجراء مقايسة الحيوية مباشرة بعد محاكاة عملية التقرن لمدة خمسة أيام، حيث يشير تحول اللون من الأزرق إلى الوردي الفاتح إلى وجود خلايا ظهارية حيوية.

بناءً على هذه التقنية، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل اختبارات التصاق البلاستوسيت (blastocyst adhesion assays)، وذلك لتقييم ما إذا كانت العوامل التي تفرزها الخلايا الظهارية في وجود البلاستوسيت يمكن أن تحفز تحول الخلايا السدوية إلى خلايا سدودة (decidualization).