عزل ماوس بطانة الرحم طلائي واللحمية خلايا ل في المختبر Decidualization

تتمثل الأهداف العامة لهذا الإجراء في عزل واستزراع خلايا بطانة الرحم الأولية للفئران واللحمة والظهارة من أجل زراعتها المشتركة لدراسة إزالة التدخين في المختبر. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الطب التناسلي مثل ما هي إشارات الباراكرين بين الخلايا الظهارية واللحمية أثناء العمليات المهمة مثل إزالة الذرات وغزو الأرومة الغاذية ، وكيف يتم تنظيم مسار الإشارات هذا. يمكن استخدام هذه التقنيات لدراسة عملية الإزالة في نظام الزراعة المشتركة الظهارية واللحمية.

باستخدام هذا النظام ، يمكنك تقييم ما إذا كانت جزيئات الإشارات التي تفرزها إحدى الخليتين يمكن أن تؤثر على هذه العملية. قبل حصاد الرحم ، قم بإجراء فحص مسحة مهبلية للتحقق من مراحل دورة. لتحديد الفئران فقط في مرحلة الشبق.

كما يتميز بوجود الخلايا الظهارية للقرنية في غسل المهبل. بعد ذلك ، استخدم الملقط والمقص لفتح بطن الشبق الأول وعكس الأمعاء إلى الجانب لتصور قرني الرحم. يمسك قرن واحد في أقصى الطرف ، تحت قناة فالوب ، وقم بتشريح أنسجة الرحم من قناة فالوب باستخدام ملقط تشريح ، وملقط دومون رقم خمسة لإزالة الأنسجة الدهنية والضامة.

ثم قم بإزالة القرن في الطرف البعيد ، فوق جسم الرحم. بعد إزالة قرون الرحم ، ضعيها في طبق بتري 35 ملم مع ثلاثة ملليلتر من HBSS. عندما يتم جمع كل قرون الرحم ، انقل الطبق تحت مجهر ستيريو ، واستخدم الملقط لإزالة أي أنسجة دهنية وضامة متبقية.

بعد ذلك ، باستخدام ملقط دومون رقم خمسة ، وتشريح الملقط والمقص الزنبركي الصغير ، افتح قرون الرحم طوليا لكشف تجويفها ، واشطف الأنسجة في طبق بتري جديد يحتوي على HBSS الطازج. الآن ، انقل جميع القرون إلى أنبوب سعة 15 مليلتر يحتوي على البنكرياتين والتربسين. واحتضان الأنسجة أفقيا لمدة 60 دقيقة عند أربع درجات مئوية و 50 دورة في الدقيقة على شاكر مداري.

في نهاية الساعة ، انقل الأنبوب إلى المقعد لمدة 45 دقيقة حضانة أفقية دون اهتزاز ، متبوعا بحضانة أفقية لمدة 15 دقيقة دون اهتزاز في حمام مائي 37 درجة مئوية. في نهاية حضانة الحمام المائي ، قم بفك المادة الطافية بعناية وانقل الرحم إلى طبق بتري يحتوي على وسط الخلية الظهارية لبطانة الرحم بالفأر البارد لمدة خمس دقائق لتعطيل نشاط التربسين. بعد ذلك ، انقل الأنسجة إلى أنبوب سعة 15 مليلتر يحتوي على ثلاثة ملليلتر من HBSS البارد ، وقم بتدوير الأنسجة لمدة 10 ثوان لتحرير الصفائح الظهارية.

بعد ذلك ، اشطف الرحم في طبق بتري جديد يحتوي على ثلاثة ملليلتر من HBSS الطازج ، واجمع معلقين آخرين للصفائح الظهارية في أنبوبين جديدين سعة 15 مليلتر كما هو موضح للتو. بعد دوامة الأنسجة الثالثة ، انقل الرحم إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر يحتوي على مزيج هضم الخلايا اللحمية بطانة الرحم للفأر لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة. استرجع الألواح الظهارية عن طريق سحب معلقات الخلايا الثلاث برفق من خلال شبكة نايلون 100 ميكرون لإزالة بقايا الأنسجة ، متبوعا بالطرد المركزي لتعليق الخلايا الناتجة.

أعد تعليق الحبيبات في 12 مل من وسط الخلية الظهارية لبطانة الرحم للفأر مع خلط شامل ، ثم اترك المحلول يستقر لمدة خمس دقائق لفصل الخلية اللحمية المتبقية لبطانة الرحم بالفأر عن طريق الجاذبية. في نهاية الترسيب ، استخدم ماصة سعة خمسة ملليلتر لإزالة المليلترين العلويين من المادة الطافية بعناية ، وأجهزة الطرد المركزي للخلايا المجمعة. بعد ذلك ، أعد تعليق الحبيبات الظهارية للفأر في وسط ظهاري مع ماصة لطيفة.

وقم بوضع الخلايا على زلات غطاء مغلفة بالكولاجين بالكثافة المناسبة لتحليل المصب المخطط له. بعد عزل الخلايا الظهارية ، استمر في الخلايا اللحمية وقم بإزالة أنبوب هضم الخلايا اللحمية للفأر مع الرحم من الحاضنة. بعد 30 دقيقة من الحضانة ، كما هو موضح للتو ، هز الأنبوب برفق باليد لمدة 10 ثوان ، وانقل الرحم إلى طبق بتري يحتوي على ثلاثة ملليلتر من أربع درجات مئوية HBSS.

اشطف الأنسجة جيدا ، ثم أضف ثلاثة ملليلتر من وسط الخلايا اللحمية إلى أنبوب الهضم لتعطيل نشاط التربسين ، وانقل الرحم إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر يحتوي على ثلاثة ملليلتر من وسط الخلايا اللحمية لبطانة الرحم الفأر الطازجة. هز أنبوب الأنسجة برفق لمدة 10 ثوان. بعد ذلك ، انقل الرحم إلى طبق من HBSS البارد ، متبوعا بنقله إلى أنبوب جديد سعة 15 مليلتر من وسط الخلايا اللحمة.

بعد شطف الأنسجة الثالثة ونقلها ، احتضان أنسجة الرحم في مزيج هضم خلايا بطانة الرحم اللحمية للفأر الطازج لمدة 30 دقيقة و 37 درجة مئوية. في نهاية عملية الهضم ، قم بتمرير معلقات الخلية من الأنبوب الأول إلى الثالث وأنبوب التربسين عبر شبكة نايلون 40 ميكرون واشطف الشبكة بخمسة ملليلتر إضافية من وسط الخلايا اللحمية بطانة الرحم للفأر. ثم اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي.

وأعد تعليق الحبيبات في وسط الخلية اللحمية بطانة الرحم الفأر الطازج للطلاء على زلات الغطاء المطلي بالبولي ليسين بالكثافة المناسبة لتحليل المصب المخطط له. يمكن تقييم نقاء مزارع الخلايا الأولية من خلال الاختلافات في تعبير الفيمنتين والسيتوكيراتين ، حيث أن مستويات الفيمنتين مرتفعة في الخلايا اللحمية بطانة الرحم للفأر ، ومنخفضة في الخلايا الظهارية لبطانة الرحم في الفئران. في حين أن مستويات السيتوكيراتين مرتفعة في الخلايا الظهارية لبطانة الرحم في الفئران ، ومنخفضة في الخلايا اللحمية بطانة الرحم للفأر.

التلوين المزدوج المنتين / السيتوكيراتين أيضا التعبير عن المنتين بواسطة الخلايا اللحمية ، بالإضافة إلى التعبير الحصري عن السيتوكاراتين بواسطة الخلايا الظهارية. يكشف تحريض إزالة التدخين في مزارع الخلايا اللحمية عن طريق تطبيق الأدينوسين أحادي الفوسفات الدوري ، و MPA ، أن مستويات البرولاكتين MRNA تزداد بشكل كبير بعد خمسة أيام من العلاج مقارنة بمزارع الخلايا اللحمية الضابطة. نظرا لأنه يصعب تصور الخلايا الظهارية في إدخالات ثقافة الخلايا الجانبية ، يمكن إجراء اختبار الجدوى مباشرة بعد محاكاة إزالة الأجزاء لمدة خمسة أيام ، مع تحول اللون من الأزرق إلى الوردي الفاتح مما يشير إلى وجود خلايا ظهارية قابلة للحياة.

باتباع هذه التقنية ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل فحوصات التصاق الكيسة الأريمية ، من أجل تقييم ما إذا كانت العوامل التي تفرزها الخلايا الظهارية في وجود الكيسة الأريمية يمكن أن تحفز تدمير الخلايا اللحمة.