حيوي داخلي المجهري والجلطة التعريفي في شحمة الأذن ماوس بلا شعر

الهدف العام من هذه التجربة هو دراسة تأثير الأدوية المحتملة التي تؤثر على الأوعية الدموية على تكوين الخثرات في الأوعية الدموية الدقيقة داخل الجسم الحي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في تكوين الخثرات، مثل تحديد مواد جديدة مضادة للتخثر يمكن أن تساعد في منع تكوين الخثرات في الأوعية الدموية الدقيقة، والتي تعد واحدة من المضاعفات الرئيسية في حالات تعفن الدم وأثناء زراعة الأنسجة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن نموذج الأذن في الفأر عديم الشعر يسمح بإجراء المجهر الفلوري الحي وتحفيز التخثر السام ضوئياً دون الحاجة إلى تحضير جراحي مسبق في الشبكة الوعائية الدقيقة التي يتم فحصها.

ابدأ بوزن الفأر وتسجيل وزنه. ثم اسحب الحجم المناسب من المادة المختبرة في حقنة أنسولين. قم بإعطاء الدواء قبل 30 دقيقة من تحفيز الخثرة.

بعد تخدير الفأر قبل 15 دقيقة من تحفيز الخثرة، ضَع الفأر مرة أخرى في القفص حتى يبدأ مفعول التخدير. وللتحقق من كفاية التخدير، اضغط على الذيل باستخدام الملقط ولاحظ عدم وجود رد فعل. بعد ذلك، اسحب 0.05 ml من Dextran 50 المذاب في حقنة إنسولين.

بعد ملء المحقنة، تأكد من عدم وجود فقاعات هواء، لأن حتى فقاعات الهواء الصغيرة التي تُعطى عن طريق الوريد يمكن أن تكون قاتلة للحيوان. ضع الفأر المخدر على وسادة acroglass مزودة بلوحة تسخين مدمجة في وضعية الانكفاء (الوجه لأسفل). اضبط لوحة التسخين على 37 درجة Celsius.

قم بتغطية قرنيات عين الفأر بمرهم العيون. بعد ذلك، قم بعمل غرزتين من البولي بروبيلين 7.0 في الحافة القحفية والذيلية للأذن اليمنى. ضع الغرز بحيث تكون قريبة قدر الإمكان من الحافة والأقرب إلى القاعدة.

قم بنقل الفأر إلى وضعية الظهر. ثبت جميع القوائم على المنصة باستخدام ضمادة لاصقة. علق خيط جراحي تحت الأسنان الأمامية، وضع الرأس في حالة بسط ظهري عن طريق تثبيت الخيط على المنصة بضمادة لاصقة.

ضع الحيوان على المنصة تحت المجهر الستيريو. استخدم تكبيراً بقوة 10X. لفحص الأذن اليمنى مجهرياً، قم بتجهيز الوريد الوداجي الأيسر من خلال إجراء شق بطول 5 mm في جلد الرقبة في اتجاه قحفي ذيلي.

بعد ذلك، استخدم ملاقط دقيقة ومقصات مجهرية لتشريح الأنسجة تحت الجلد. ثم قم بتحرير الوريد من الغلالة الخارجية دون لمس الوعاء الدموي. الآن، استخدم حقنة الإنسولين التي تم تحضيرها مسبقاً لحقن الصبغة الفلورية.

أمسك جدار الوعاء الدموي بعناية باستخدام الملقط الدقيق دون ثقب الوريد. اخترق جدار الوعاء المتوسع بإبرة السرنجة واحقن 50 Dextran وريدياً. اسحب الإبرة وأوقف النزيف باستخدام مسحات قطنية.

تجنب تلوث الأذن بالدم والصبغة. انقل الحيوان الموجود على لوحة التسخين إلى هيكل زجاجي مخصص (acro glass) يحتوي على شريحة للوحة التسخين ومستوى بارتفاع 0.5 cm لتحديد وضعية الأذن. ثبت الحيوان في وضعية الانبطاح على لوحة التسخين باستخدام ضمادة لاصقة.

ضع الغضروف المحدب عند قاعدة الأذن بجانب سطح الأذن بحيث يمكن وضع الجزء القمي من الأذن بشكل مسطح على السطح. أضف قطرة واحدة من الماء بدرجة حرارة الغرفة إلى لوح زجاجي من نوع acro. باستخدام مسحات قطنية، امتص قطرة الماء، واترك قوى الخاصية الشعرية تثبت سطح الأذن على الزجاج من نوع acro.

يجب وضع صيوان الأذن بحيث يكون مسطحاً قدر الإمكان، على الرغم من أن الغضروف يمنح الصيوان شكلاً محدباً. لذا، ينبغي وضع الجزء القاصي الأكثر مرونة من الصيوان فقط على لوح الزجاج الأكريليكي. ولتجنب تلف الأنسجة وتسرب السوائل والصبغة، يجب لمس الأذن بالملقط بأقل قدر ممكن.

بعد ذلك، أضف قطرة من aqua إلى الجانب الظهري المحدب للأذن. ضع غطاءً زجاجياً واحداً بعناية فوق الأذن دون الضغط على الأوعية القاعدية التي تدخل إلى الأذن. استخدم مساحات قطنية لإزالة أكبر قدر ممكن من aqua من تحت الغطاء الزجاجي لتقليل المسافة بين الغطاء الزجاجي والأوعية المستهدفة في الأذن.

ابدأ بضبط مجهر الفلورية الحيّ لتصوير الـ 50 Dextran. انقل الحيوان المُجهز إلى منصة مجهر الفلورية الحيّ. وباستخدام تكبيرات 5X و 10X و 20X، وبكثافة ضوئية تبلغ 20%، ابحث عن وعاء وريدي يتراوح قطره بين 50 إلى 60 ميكرون ويكون تدفق الدم فيه في الاتجاه الأمامي.

أضف قطرة واحدة من الماء بدرجة حرارة الغرفة إلى الغطاء الزجاجي لغمر العدسة الشيئية بقوة تكبير 63X في الماء. مباشرة بعد وضع قطرة الماء، ابدأ بتسجيل الوعاء لمدة 20 ثانية لإجراء التقييم المرجعي للقطر وتدفق الدم. ابدأ عملية تحفيز الخثرة بعد خمس دقائق من حقن 50 Dextran.

لهذا الغرض، ارفع شدة الضوء إلى 100%. أثناء تحريض الخثرة السامة ضوئياً، أغلق فتحة المجهر لمدة ثانيتين خلال فترة زمنية مدتها 30 ثانية للتحقق من انسداد تدفق الدم. إذا استمر تدفق الدم، افتح الفتحة مرة أخرى. يُصنف الوعاء الدموي على أنه مسدود إذا توقف التدفق لمدة 30 ثانية أو أكثر، أو إذا كان تدفق الدم تراجعياً.

اختر وقم بسد خمسة أوعية دموية لكل أذن خلال فترة ساعة واحدة بعد حقن 50 Dextran. في هذه التجربة، عولجت الحيوانات باستخدام المادة الحاملة (vehicle) أو باستخدام الكانابينويدات، وهي anandamide أو WIN 155, 212-2 أو cannabidiol، قبل حقن 50 Dextran وبصورة سابقة لتحفيز تكون الخثرة. وقد أدى anandamide، ولكن ليس CBD أو WIN 155, 212-2، إلى تسريع نمو الخثرة بشكل ملحوظ بعد العلاج لمرة واحدة مقارنة بمجموعة التحكم التي تلقت المادة الحاملة.

وفي سياق آخر، تم دمج anandamide مع indomethacin لتقييم تأثير النواتج المعتمدة على cyclooxygenase على تكوين الخثرة عبر anandamide. وقد أدى الإعطاء المشترك مع indomethacin إلى تحييد التأثير المحفز لتكوين الخثرات لـ anandamide. وبناءً على ذلك، فإن التعرض الحاد لـ anandamide يثير تأثيراً محفزاً لتكوين الخثرات يعتمد على cyclooxygenase في الجسم الحي (in vivo).

بمجرد إتقان هذه العملية، يمكن إجراء تحفيز الخثرة في الأوعية الضيقة خلال 90 دقيقة، بما في ذلك التحضير. وأثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم التعامل مع صيوان الأذن بحذر شديد في كل مرة يتم لمسه فيها لتجنب تسرب السوائل والصبغة. ورغم أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤية حول تكوين الخثرة، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً على أنظمة أخرى، مثل التئام الجروح، وفشل السديلة، وتكون الأوعية الدموية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية تطبيق صبغة الفلوريسنت عن طريق الوريد، وموضع الصيوان، وإضاءة أوعية دموية محددة من أجل إجراء تحريض للخثرة السامة ضوئياً داخل الجسم الحي.