تحليل متشابك التحوير من ذبابة الفاكهة خلايا مستقبلة للضوء بعد التعرض للضوء لفترات طويلة

الهدف العام من هذا الإجراء التجريبي هو فهم الديناميكيات المشبكية في خلية عصبية واحدة في ظل ظروف تنشيط مختلفة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال اللدونة المشبكية مثل الكشف عن التغيرات في التركيب الجزيئي للمشابك عند نضوج نشاط الخلايا العصبية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بالتحليل شبه الآلي لجوانب متعددة من نقاط الاشتباك العصبي بما في ذلك عددها وتوزيعها ومستوى إثراء المكونات الجزيئية بعد نقاط الاشتباك العصبي.

في هذه التجربة ، اجمع الذباب في قوارير عادية في غضون ست ساعات من الانغلاق. قم بتحميل قوارير التجميع في رف أكريليك شفاف. في حاضنة صغيرة مضبوطة على 25 درجة مئوية ، ضع الحامل على مسافة دقيقة من لوحة LED حيث يكون التعرض للضوء في المتوسط 1000 لوكس.

بعد ذلك ، يطير في الخلف لمدة يوم إلى ثلاثة أيام باستخدام أحد الشروط التالية ، إما ظلام مستمر ، أو 12 ساعة من الضوء متبوعا ب 12 ساعة من الظلام ، أو ضوء مستمر. في وقت لاحق ، قم بتشريح الأدمغة وصخبها باستخدام التقنيات القياسية. لتركيب أدمغة الذبابة ، قم بتحميل ماصة دقيقة بوسيط تركيب وقم بإيداع قطرتين بحجم 2 ميكرولتر في وسط شريحة المجهر على بعد حوالي 2 سم.

ضع زلة غطاء على كل قطرة والفجوة بين حوالي 0.2 مم. ثم قم بإيداع 15 ميكرولترا من وسط التركيب فوق زلات الغطاء وفي الفجوة. تحت المجهر التشريحي ، قم بإيداع الدماغ في الفجوة من الماصة الدقيقة.

ثم ضع الأدمغة ، الجانب البطني لأعلى. أخيرا ، قم بإرفاق زلة غطاء وإغلاقها على طول الحواف باستخدام طلاء أظافر شفاف. يمكن بعد ذلك تصوير الأدمغة باستخدام التقنيات القياسية لإعادة تكوين الصور ثلاثية الأبعاد.

في هذه الحالة ، يتم توثيق تلألؤ GFP في الخلايا ذات تعبير Brp النشط باستخدام طريقة النجمة. في هذا المثال أيضا ، تم مناعة محاور المستقبلات الضوئية R7 و R8 باستخدام مضادات السياوبتين ، والتي تم عرضها باستخدام الأجسام المضادة الثانوية الموسومة ب RFP. لتحديد عدد وتوزيع ومستوى إلغاء تحديد موقع Brp GFP puncta أولا تحميل صور ثلاثية الأبعاد للدماغ مصنوعة من مكدسات الصور.

يتم عرض Brp puncta باللون الأبيض. الآن ، أوجد منطقة الاهتمام. في هذه الحالة ، توجد أطراف محور عصبي R8 باتباع ترقق المحاور الإيجابية المضادة للأوبتين عند نقطة الدخول إلى طبقة النخاع M3.

في كل طرف محوري R8 ، حدد نقطة Brp GFP باستخدام وحدة الكشف عن البقعة. حدد إضافة نقاط جديدة، ثم حدد تقسيم منطقة الاهتمام فقط في إعدادات الخوارزمية. بمجرد تحديد منطقة التحليل ، اضبط القناة المصدر على Brp GFP ثم اضبط قطر XY المقدر على 0.35 ميكرون.

وبعد ذلك ، تحقق من طرح الخلفية في الكشف عن البقعة. بعد ذلك ، حدد الجودة كنوع عامل التصفية ، ويتم تصفية النقاط تلقائيا. أكمل هذه الخطوة بالنقر فوق إنهاء.

كرر طريقة الكشف عن النقاط لجميع محاور R8 في مجموعة البيانات. المنطقة التالية التي يجب تحديدها هي السيتوبلازم المحوري. أولا ، قم بإنشاء كائنات سطحية باستخدام وظيفة السطح.

بعد ذلك، حدد إضافة أسطح جديدة، وضمن إعدادات الخوارزمية، قم بتبديل منطقة الاهتمام فقط إلى المقطع. الآن ، حدد يدويا منطقة الاهتمام. بعد ذلك ، قم بتعيين محيط الحساب.

للعثور على قناة المستقبلات الضوئية كمصدر ، حدد الخيار السلس. بالنسبة للحد ، حدد الكثافة المطلقة. قم بتمكين خيار تقسيم الكائنات التي تلمس النواقص.

اضبط قطر نقاط المقعد على 0.5 ميكرون واستخدم إعدادات المرشح الافتراضية لجودة وعدد الفوكسل. ثم يتم تطبيق الفلتر تلقائيا. الآن ، انتقل إلى تحرير وحذف أجزاء السطح التي تم إنشاؤها خارج منطقة الاهتمام.

في هذه الحالة ، المحاور الأخرى. بعد تكرار اكتشاف منطقة المحور العصبي لجميع محاور R8 في مجموعة البيانات ، يتم تحديد جميع محاور Brp puncta و R8 كمجموعة من الكائنات الموضعية. ويتم تحديد المناطق السيتوبلازمية المقابلة على أنها أجسام سطحية.

الآن ، تابع عن طريق تحديد اتجاه ومساحة كل محور عصبي يدويا. هذا مهم للقياس الكمي لاحقا لكثافة Brp GFP على طول كل خلية عصبية في نخاع الأعصاب. للقيام بذلك ، حدد أولا نقاط البداية ونقاط النهاية.

حدد إضافة نقاط قياس جديدة، ثم حدد تحرير متبوعا بتحديد سطح الكائن للعمل مع الجزء العلوي من كائنات السطح. لتحديد نقاط البداية ، ضع نقاط القياس على جميع الكائنات السطحية للمحاور R في الطبقة M1. ضع هذه النقاط بترتيب منهجي قابل للتكرار.

بعد ذلك ، حدد نقاط النهاية. حدد إضافة نقاط قياس جديدة وتحرير وسطح الكائن مرة أخرى. بعد ذلك ، مع تكرار نفس الترتيب المنهجي ، ضع نقاط القياس في الجزء السفلي من محاور R في طبقة M3.

لتحديد كثافة خلفية Brp ، قم بتحليل المناطق السيتوبلازمية لمحورين عصبي R7. حدد إضافة أسطح جديدة وحدد منطقة محور عصبي R7 يدويا كما تم لمحاور R8. استخدم إعدادات متطابقة باستثناء عدم التبديل إلى خيار تمكين تقسيم الكائنات.

اترك هذا. بعد ذلك ، أضف كائنا وهمية داخل منطقة محورية R7 محددة. حدد إضافة مواقع جديدة، وحدد تخطي الإنشاء التلقائي، وقم بالتحرير يدويا.

ثم حدد مركز الكائن وانقر على الكائن السطحي لوضع كائن البقع الوهمية داخل محور R7. الآن ، كرر خطوات الكشف عن السطح والبقع لمحور عصبي R7 ثان. ثم حدد نقاط البداية والنهاية للمحاور R7 كما هو الحال مع محاور R8.

لهذا التحليل ، تأكد من تثبيت البرنامج الصحيح. افتح مجموعة البيانات التي تحتوي على البيانات الموضعية وبيانات الأسطح وكائنات نقطة القياس ، يحتوي كل منهما على نفس عدد نقاط القياس. افحص البيانات.

يجب أن يكون لكل من كائنات نقطة القياس نفس عدد نقاط القياس حتى تعمل العمليات الحسابية. بمجرد تحديد النقاط ومناطق المحور العصبي ونقاط البداية والنهاية ، ابدأ تشغيل المكون الإضافي. أولا ، تحقق من البيانات الوصفية ، على وجه الخصوص ، حجم فوكسيل.

افتح خصائص الصورة من تحرير ، ثم تحقق من الأبعاد الثلاثة للفوكسل والميكرون تحت الإحداثيات في الهندسة. بعد ذلك ، حدد قناة لتحليل الكثافة. في هذه الحالة، يتم تحديد القناة التي تعرض Brp GFP.

ثم حدد اسم الملف للنتائج. بعد ذلك ، حدد عدد الصناديق على أنها 10 ، واضبط طول المحور العصبي على 100٪ ثم حدد مناطق النقطة عن طريق ضبط نصف قطر البقعة على 0.35 ميكرون والمنطقة السيتوبلازمية المحيطة بها على 50 ميكرون. أخيرا ، قم بتنفيذ أمر اكتشاف المشبك ، وبعد ذلك ، قم بتحليل الإخراج إحصائيا.

باتباع البروتوكولات الموصوفة ، تم تحليل نقاط الحفر Brp GFP في نقاط الاشتباك العصبي R8 للذباب المعرض للظلام المستمر أو الضوء المستمر أو دورة الضوء / الظلام العادية. تم تقليل عدد النقاط النقطية Brp بشكل كبير في المستقبلات الضوئية R8 للذباب المحفوظ في ضوء مستمر. تم حساب توزيع النقطة باستخدام مكون إضافي مخصص.

توزيع نقاط الاشتباك العصبي R8 على طول العمود المحوري من M1 إلى طبقة M3 ، لكن كثافتها كانت أعلى في طبقات M1 و M3. وبالمثل ، تم حساب مستويات إلغاء تمركز النقطة. لم تتغير في جميع الظروف ، لكن مستويات إلغاء توطين Brp GFP اختلفت عن المراسلين الآخرين ، مثل Brp-short-cherry الذي يتم نزع فتيله بوضوح تحت الضوء المستمر.

من الممكن أن تكون هناك معالجة غير مناسبة لجزء Brp القصير بعد تفكيكه من AZ. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحليل خصائص البلاستيك المشبكي في خلية عصبية واحدة. تتضمن هذه الخصائص البلاستيكية عدد المشبك وتوزيعها وتسمية تخصيب مكون جزيئي معين بعد نقاط الاشتباك