وحيدة الخلية التعبير الجيني التنميط عن طريق نظام مراقبة الأصول الميدانية وQPCR مع المعايير الداخلية

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد مستويات mRNA في الخلايا الفردية باستخدام qPCR الموائع الدقيقة مع المعايير الداخلية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال بيولوجيا الخلية المفردة ، مثل ما إذا كانت مجموعات خلايا الخلايا تستجيب للمحفز بطرق مختلفة بشكل مميز. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها يمكن أن تقيس التعبير عن جينات أكثر من RNA FISH بتكلفة أقل من RNA-Seq في الخلايا المفردة.

خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما كنا نستكشف بروتوكولات لقياس التعبير الجيني في الخلايا المفردة بواسطة qPCR الموائع الدقيقة. أردنا تعديل الطرق الحالية لتقدير العدد المطلق للنصوص المختلفة في الخلايا المفردة بشكل أكثر دقة. سيوضح ويليام تيلفورد ، مدير منشأة قياس التدفق الخلوي التي يستخدمها مختبري.

بعد توليد وتنقية الأمبليكونات من الجينات ذات الأهمية وفقا لبروتوكول النص ، اجمع بين 18 ميكرولترا من كل أمبليكون منقى في أنبوب طرد مركزي دقيق منخفض الارتباط سعة 2.0 مليلتر ، ثم أضف عازلة تعليق الحمض النووي حتى 1 ، 800 ميكرولتر بحيث يكون تركيز كل أمبليكون خمسة في 10 إلى الجزيئات السادسة لكل ميكرولتر. قم بتدوير معيار 5e6 جيدا وقسمه إلى 20 ميكرولتر في أنابيب PCR منخفضة الربط. بعد طلاء خلايا MCF7 p53-Venus وفقا لبروتوكول النص ، أضف 400 نانوجرام لكل مليلتر من النيوكارزينوستاتين إلى الخلايا وقم بمعالجتها لمدة ثلاث أو 8.5 أو 14 أو 24 ساعة.

لإنشاء مخزن مؤقت للتحلل ، اجمع الكواشف المدرجة في هذا الجدول. انقل 92.4 ميكرولترا من المخزن المؤقت إلى أنبوب منفصل ليكون بمثابة عازلة التحلل لمعايير Amplicon. سيكون المخزن المؤقت المتبقي للتحلل للخلايا.

قم بإعداد وإضافة الحمض النووي للإشريكية القولونية إلى المخزن المؤقت للتحلل للخلايا ، وفقا لبروتوكول النص. لإعداد المعايير ، قم بتسمية ستة أنابيب طرد مركزي منخفضة الربط. أضف 90 ميكرولترا من المخزن المؤقت لتعليق الحمض النووي إلى أنبوب 5e5.

أضف 90 ميكرولترا من المخزن المؤقت الذي يحتوي على 6.2 بيكوغرام لكل ميكرولتر من الحمض النووي الإشريكية القولونية إلى كل من الأنابيب الخمسة الأخرى واحتفظ بجميع الأنابيب على الجليد. بعد إزالة كمية من معيار 5e6 من التخزين ، قم بتدوير الأنبوب لفترة وجيزة ، ثم قم بتدويره للتأكد من أن السائل في قاع الأنبوب ، ثم باستخدام طرف ماصة منخفض الربط ، أضف 10 ميكرولترات من معيار 5e6 إلى أنبوب 5e5. دوامة ، تدور وإعادة الأنبوب إلى الجليد.

بعد ذلك ، قم بتدوير 10 ميكرولتر من الأنبوب 5e5 إلى أنبوب 5e4 ، ثم قم بتدوير الأنبوب لفترة وجيزة ، وقم بتدويره ، وإعادة وضع الأنبوب مرة أخرى على الجليد. كرر التخفيفات التسلسلية مع كل أنبوب ، وتلقي 10 ميكرولتر من الأنبوب السابق حتى يكون لجميع الأنابيب تخفيف قياسي. بعد تحضير أنابيب تفاعل البوليميراز المتسلسل مع عازلة التحلل ، باستخدام ماصة 12 قناة ، قم بتوزيع تسعة ميكرولترات من المخزن المؤقت لتحلل الخلايا من صف أنابيب تفاعل البوليميراز المتسلسل في كل بئر من الصفوف السبعة الأولى من لوحة PCR.

قم بتوزيع سبعة ميكرولترات من المخزن المؤقت للتحلل القياسي على كل بئر من الصف الأخير من اللوحة ، ثم باستخدام أطراف ماصة منخفضة الربط ، أضف ميكرولترين من المعيار إلى كل بئر من الصف السفلي وفقا لخريطة اللوحة. أضف ميكرولترين من 3.1 بيكوغرام لكل ميكرولتر من الحمض النووي الإشريكية القولونية إلى 10 خلايا و 100 بئر خلية ، ثم أضف ميكرولترين من 6.2 بيكوغرام لكل ميكرولتر من الحمض النووي الإشريكية القولونية في الآبار الخالية من الخلية. بعد برمجة فارز الخلية المنشط بالفلورة للفرز في لوحة 96 بئر وفقا لخريطة اللوحة ، لتوجيه الماكينة ، وإغلاق لوحة PCR فارغة واستخدام دفق الاختبار لفرز القطرات و PBS على ختم اللوحة الفارغة.

إذا لم تهبط القطرات في الموضع الصحيح ، فقم بمسحها عن سطح مانع التسرب ، وأعد معايرة فارز الخلايا وفقا لتعليمات الشركة المصنعة للماكينة ، وكرر ذلك حتى يتم ترسيب القطرات الموجودة في تيار الفرز بشكل صحيح. حصاد الخلايا عن طريق التربسين وإعادة تعليقها في 0.5 مل من PBS مع 2٪ FBS ، ثم نقلها إلى أنبوب قياس التدفق الخلوي. لفرز الخلايا ، أدخل الأنبوب مع تعليق الخلية في فارز الخلايا ، وافتح الختم الموجود على لوحة عازلة التحلل ، وفرز الخلايا ذات الأهمية بعناية في اللوحة وفقا لخريطة اللوحة.

لضمان فرز الخلايا المفردة بأقصى قدر من النقاء ، قم بتشغيل الجهاز في وضع الخلية الواحدة واستخدم بوابات قياس التدفق الخلوي القياسية بناء على التشتت الأمامي والجانبي. بعد التشغيل ، استخدم ختما حراريا معقما جديدا لإغلاق اللوحة وقم بطردها عند 400 مرة جم لأربع درجات مئوية لمدة دقيقة واحدة ، ثم ضع اللوحة في جهاز التدوير الحراري وقم بتشغيل برنامج RT-STA المعد مسبقا. بعد تدوير لوحة RT-STA المكتملة، استخدم ماصة ذات 12 قناة لتوزيع 3.6 ميكرولتر من نوكلياز خارجي المخفف I في كل بئر من اللوحة.

أغلق اللوحة وقم بتدويرها لفترة وجيزة ، ثم ضع اللوحة في جهاز التدوير الحراري وقم بتشغيل برنامج exo I. لقياس التعبير الجيني للتدبير المنزلي في كل عينة ، قم بإعداد 900 ميكرولتر من مزيج qPCR الرئيسي لصبغة ربط الحمض النووي ل 96 تفاعلا باستخدام بادئات من أحد جينات التدبير المنزلي المختارة. قم بتوزيع تسعة ميكرولترات من المزيج الرئيسي على كل بئر من لوحة PCR سعة 96 بئر ، ثم أضف ميكرولتر واحد من العينة من لوحة العينة إلى البئر المقابل للوحة PCR.

قم بتشغيل اللوحة على جهاز PCR في الوقت الفعلي باستخدام بروتوكول التدوير الحراري الذي اقترحته الشركة المصنعة للخلطة الرئيسية أو باتباع بروتوكول قياسي ، ثم قم بتحليل العينات وقم بعمل عينة من خريطة لوحة الخلطات وفقا لبروتوكول النص. قم بتسمية خلطات عينة اللوحة ثم ، باستخدام ماصة ثماني قنوات ، قم بتوزيع 3.3 ميكرولتر من خليط كاشف تحميل عينة المزيج الرئيسي في كل بئر من لوحة PCR سعة 96 بئر. لكل لوحة PCR من العينات ، قم بتدوير اللوحة لمدة 10 ثوان وتدويرها عند 500 مرة جم لمدة 10 ثوان.

قم بإزالة الغطاء وانقل 2.7 ميكرولتر من كل عينة خلية واحدة موجبة إلى البئر المقابل لها على لوحة خلطات العينة لآبار الخلية الواحدة الموضحة في خريطة اللوحة. انزع الملصق من الجزء السفلي من شريحة qPCR الموائع الدقيقة الجديدة ، ثم استخدم حقنة من سائل خط التحكم مع استمرار الغطاء ، وادفع كل زنبرك تراكم لأسفل لفكه وحقن كل مجمع ب 100 إلى 200 ميكرولتر من سائل خط التحكم. أدخل الشريحة في ماكينة التحميل وقم بتشغيل البرنامج النصي الأساسي، ثم باستخدام ماصة ثماني القنوات، انقل 4.5 ميكرولتر من كل مزيج فحص إلى الجانب الأيسر من شريحة qPCR الموائع الدقيقة.

من الأهمية بمكان تجنب تكوين فقاعات هواء في قاع الآبار. سيؤدي ذلك إلى حدوث مشاكل في التحميل. لمنع ذلك، المس أطراف الماصة على جانب البئر، ثم الماصة حتى المحطة الأولى فقط.

انقل 4.5 ميكرولتر من كل مزيج عينة إلى الجانب الأيمن من شريحة qPCR الموائع الدقيقة ، ثم أدخل الشريحة في آلة التحميل وقم بتشغيل البرنامج النصي لمزيج الحمل. عند الانتهاء من البرنامج النصي لمزيج التحميل ، تحقق من عدم وجود خطوط عبر الشريحة ، مما قد يشير إلى وجود مشكلة في التحميل ، ثم استخدم الشريط لإزالة أي جزيئات غبار بعناية من الشريحة ، ثم أدخل الشريحة في جهاز PCR في الوقت الحقيقي للموائع الدقيقة وقم بتشغيل البرنامج النصي لجمع البيانات. أخيرا ، قم بتحليل البيانات وفقا لبروتوكول النص.

يوضح هذا الشكل مستويات التعبير عن جين التدبير المنزلي الذي تم قياسه بواسطة qPCR لتحديد الآبار التي تلقت خلية واحدة. العينات التي تلقت خلية لها قيم منخفضة للتصوير المقطعي المحوسب. العينات التي لا تحتوي على خلية لها قيم CT أعلى بكثير.

يجب أن تظهر الآبار الخاصة بمعيار amplicon منحنيات تضخيم متباعدة بشكل متساو. يجب أن يكون هناك أيضا فصل واضح في المنحنيات للبئر بدون خلية و 10 خلايا و 100 خلية. يتم قطف عينات الحمض النووي للبذور التي تمثل الخلايا الفعلية من عدة ألواح بئر 96 مصنفة ويتم دمجها في صفيحة واحدة للتحضير ل qPCR الموائع الدقيقة.

تلخص هذه الخريطة الحرارية نتائج qPCR للموائع الدقيقة. يظهر تباين اللون في كل عمود التباين في التعبير عن كل جين بين الخلايا المختلفة. الصفان اللذان أغمق بكثير من الباقي يمثلان على الأرجح عينات سيئة.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم الحفاظ على منطقة عملك خالية من RNase وخالية من الحمض النووي ، خاصة عند وضع المعايير والمخزن المؤقت للتحلل. أجزاء ما قبل تفاعل البوليميراز المتسلسل من هذا البروتوكول حساسة للتلوث. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحديد التعبير عن الجينات المتعددة ذات الأهمية في الخلايا الفردية.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى ، مثل الجزيء الفردي RNA FISH للتحقق من قياسات وفرة mRNA في الخلايا المفردة.