رسم الخرائط التفاعلات رنا-رنا على الصعيد العالمي باستخدام السورالين البيروكسيديز

الهدف العام من هذا الفيديو هو وصف طريقة تسلسل الهجينة المتشابكة والمختارة أو SPLASH ، حيث يتم تعيين تفاعلات الحمض النووي الريبي والحمض النووي الريبي الزوجية في الجسم الحي بطريقة على مستوى الجينوم. هذه التقنية هي طريقة بسيطة وعالية الإنتاجية لرسم خرائط تفاعل الحمض النووي الريبي في الجسم الحي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال جينوم الحمض النووي الريبي مثل كيفية تفاعل المناطق المختلفة على طول خيط واحد من الحمض النووي الريبي أو بين خيوط مختلفة من الحمض النووي الريبي مع بعضها البعض.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة على الخميرة والخلايا البشرية ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على الدراسات التي أجريت على الكائنات الحية الحديثة الأخرى بما في ذلك البكتيريا والأغشية في الخلايا. خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما أردنا التوصل إلى طريقة لرسم خريطة للتفاعل الجزيئي. لاحظ أن الإجراء التالي يحتوي على عدة نقاط توقف.

في هذه الأوقات ، يمكن إيقاف التجربة مؤقتا لفترة وجيزة أو إلى أجل غير مسمى. يمكن العثور على التفاصيل في النص المصاحب. ابدأ هذا الإجراء بغسل خلايا HeLa مرتين بخمسة ملليلتر من PBS.

ضع الطبق عموديا لمدة دقيقة واحدة لتصريف أي PBS زائد تماما. بعد ذلك ، أضف ملليلترا واحدا من PBS يحتوي على 200 ميكرومولار بيوتينيل سورالين و 0.01٪ ديجيتونين مما يزيد من نفاذية الخلية. احرص على إضافة المحلول بالتساوي على سطح الخلايا.

احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. بعد الحضانة ، قم بإزالة غطاء الطبق وضعه على الجليد داخل الأشعة فوق البنفسجية Crosslinker على بعد ثلاثة سنتيمترات من لمبة الأشعة فوق البنفسجية. تشعيع بالأشعة فوق البنفسجية 365 نانومتر لمدة 20 دقيقة.

بعد 20 دقيقة ، قم بإزالة الطبق من Crosslinker ثم عزل الجزء وترسيب الحمض النووي الريبي من خلايا HeLa وفقا للتعليمات الواردة في المستند المصاحب. قم بتحميل عينات السلم والحمض النووي الريبي المشوهة على 8.6 سم مربع 6٪ TBE-urea gel. تجزئة الحجم بواسطة الرحلان الكهربائي عند 180 فولت لمدة 40 دقيقة.

قم بتلطيخ الجل في 10 مل من المخزن المؤقت TBE الذي يحتوي على تخفيف 1: 10 ، 000 من صبغة هلام الحمض النووي لمدة خمس دقائق في الظلام. أثناء تلطيخ الجل ، استخدم إبرة قياس 24 لثقب أنبوب ميكروفوج نظيف سعة 0.6 مليلتر في الأسفل. ضعه في أنبوب ميكرو فوج سعة ملليلتر.

باستخدام transilluminator ، تصور العصابات الموجودة على الجل الملون بعد البقع وقطع شريحة هلام تتوافق مع 90 إلى 110 نيوكليوتيدات. انقل شريحة الجل إلى أنبوب الطرد الدقيق المثقوب سعة 0.6 مل في أنبوب الطرد الدقيق سعة ملليلتر. يسمح لنا اختيار الحجم بتعيين الحد الأدنى لطول الأجزاء الوهمية والتمييز بين المنتجات المربوطة والمنتجات غير المربوطة لاحقا.

الطرد المركزي شرائح الجل عند 12 ، 000 مرة في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين لتقطيع شريحة الجل وجمعها في أنبوب ميكرو فوج سعة ملليلترين. بعد الدوران ، تخلص من أنبوب الجراد الدقيق الفارغ سعة 0.6 ملليلتر. إلى شريحة الجل المقطعة ، أضف 700 ميكرولتر من محلول الشطف.

احتضن عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها مع دوران مستمر للسماح بانتشار العينات في المخزن المؤقت. انقل شرائح الجل ومخزن الشطف إلى مرشح أنبوب الطرد المركزي وجهاز الطرد المركزي عند 20،000 مرة جم لمدة 20 دقيقة. بعد الدوران ، سيتم احتجاز شرائح الجل في المقصورة العلوية للمرشح والتي يمكن التخلص منها.

تسريع وتحديد الحمض النووي الريبي كما هو موضح في المستند المصاحب. قم بتجميد الحمض النووي الريبي وتخزينه عند 80 درجة مئوية تحت الصفر في النيتروجين السائل حتى يتم استخدامه. لإثراء مناطق التشابك بين الحمض النووي الريبي ، ابدأ بإضافة 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل الذي يحتوي على مثبط RNase لغسل الخرز المغناطيسي المطلي بالستربتافيدين في أنبوب ميكروفوج.

إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 15 مليلتر ، أضف ملليلترين من مخزن التهجين المحضر حديثا ، ومليلتر واحد من المخزن المؤقت للتحلل المكمل ، و 1.5 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي المجزأ بحجم ، و 100 ميكرولتر من الخرز المعلق. دوامة الأنبوب برفق. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع دوران من طرف إلى طرف.

بعد الحضانة ، اغسل الخرزات خمس مرات باستخدام مخزن غسيل مسخن مسبقا. في نهاية الغسيل الخامس ، ضع أنبوب الطرد الدقيق الذي يحتوي على الخرز على حامل المغناطيس لمدة دقيقة واحدة ثم قم بإزالة مخزن الغسيل. أضف ملليلترا واحدا من محلول بولي النوكليوتيدات البارد T4 إلى الخرز المغسول.

احتضن الخرزات لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية مع دوران من طرف إلى طرف. ضع أنبوب الطرد الدقيق الذي يحتوي على الخرز على الشريط المغناطيسي. بعد دقيقة واحدة ، قم بإزالة المخزن المؤقت برفق.

كرر هذه الخطوة لمدة غسلتين وقم بإزالة المخزن المؤقت بعد الغسيل الأخير. بعد ذلك ، اتبع التعليمات الواردة في المستند المصاحب لتحويل الأطراف الأولية الخمسة والثلاثة الأولية لتكون متوافقة مع الربط وإجراء ربط التقارب. بعد الغسيل ، أضف 100 ميكرولتر من مخزن RNA PK المؤقت إلى الخرزات وأعد تعليقها عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل.

سخني العينات على حرارة 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق على كتلة حرارية. بعد ذلك ، قم بتبريد العينة على الجليد لمدة دقيقة واحدة. أضف 500 ميكرولتر من غوانيدينيوم ثيوسيانات - فينول - كلوروفورم إلى العينة.

تخلط عن طريق الدوامة بقوة لمدة 10 ثوان. احتضن الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. بعد الحضانة ، استخدم مجموعة لترسيب الحمض النووي الريبي وتنظيفه واستعادته ، وتأكد من الاحتفاظ حتى بالحمض النووي الريبي الصغير.

قم بتخفيض الحمض النووي الريبي في 100 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز. انقل 100 ميكرولتر من العينات المملوءة إلى بئر من لوح 24 بئرا على لطيف. مع إبقاء العينة على الجليد ، تشع الأشعة فوق البنفسجية على ارتفاع 254 نانومتر لمدة خمس دقائق.

انقل العينة المتشابكة العكسية إلى أنبوب ميكرو فوج نظيف. أضف 10 ميكرولتر من أسيتات الصوديوم ، وميكرولتر واحد من الجليكوجين ، و 300 ميكرولتر من 100٪ إيثانول. ترسيب الحمض النووي الريبي عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر لمدة ساعة واحدة على الأقل.

لاستعادة الحمض النووي الريبي ، قم بالطرد المركزي للحمض النووي الريبي المترسب عند 20 ، 000 مرة جم لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية. بعد الدوران ، قم بإزالة المادة الطافية وأضف ملليلترا واحدا من 70٪ من الإيثانول البارد لغسل حبيبات الحمض النووي الريبي. الطرد المركزي الحبيبات المغسولة عند 20 ، 000 مرة جم لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية.

قم بإزالة مخزن الغسيل وأضف 4.25 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز لإعادة تعليق الحمض النووي الريبي. انقل الحمض النووي الريبي إلى أنبوب PCR سعة 0.2 ملليلتر. أخيرا ، قم بعكس نسخ (كدنا) وتدويمه وتضخيمه وفقا للتعليمات الواردة في المستند المصاحب.

يصور هذا التخطيطي سير عمل SPLASH. عند إضافة البيوتينيل السورالين في وجود 0.01٪ ديجيتونين والأشعة فوق البنفسجية ، يتم استخراج الحمض النووي الريبي الكلي من الخلايا ويتم إجراء لطخة نقطية للتأكد من أن التشابك كان فعالا. ثم يتم استخدام oligos 20 قاعدة بيوتينيل كعناصر تحكم إيجابية لمعايرة كمية البيوتينيل السورالين المراد إضافتها إلى الخلايا بحيث يتم ربط واحد تقريبا من كل 150 قاعدة.

ثم يتم إجراء تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل على نطاق صغير باستخدام أعداد متزايدة من دورات تفاعل البوليميراز المتسلسل لتحديد الحد الأدنى لعدد الدورات المطلوبة للتسلسل العميق. في عملية إعداد مكتبة فعالة ، يمكن تضخيم مكتبة تسلسل (كدنا) من 1.5 ميكروغرام من مدخلات الحمض النووي الريبي المحددة بحجم أقل من 15 دورة من تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). ثم يتم تسلسل المكتبة باستخدام قراءتين 150 زوجا أساسيا على جهاز التسلسل العالي.

ثم تتم معالجة قراءات التسلسل وفقا لخط الأنابيب الحسابي. والنتيجة النهائية هي قائمة بالتفاعلات الخيمرية المفلترة التي تتضمن تفاعلات الحمض النووي الريبي والحمض النووي الريبي داخل الجزيئات وبين الجزيئات في النسخ. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر التحقق من دمج البيوتينيل السورالين عند استخدام سبلاش على كائنات جديدة.

بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال بيولوجيا الحمض النووي الريبي لاستكشاف تفاعلات الحمض النووي الريبي في الكائنات الحية المتنوعة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنشاء مكتبة تسلسل تلتقط تفاعلات الحمض النووي الريبي الزوجية على مستوى العالم في الخلية.