الكالوري الضوئي التفاضلية - منهج في تقييم الثبات الحراري والتشكل من البروتين مستضد

الهدف العام من هذا الإجراء هو تقييم الاستقرار الحراري والتشكل الهيكلي للبروتينات في بيئة صناعية باستخدام كالوريمتر المسح التفاضلي. يقيس كالوريمتر المسح التفاضلي السعة الحرارية المولية للعينات كدالة لدرجة الحرارة وقد تم استخدامه بنجاح لتقييم الاستقرار الحراري والتشكل الهيكلي للبروتينات. لا يعتمد هذا الإجراء البسيط نسبيا على الهيلوبية الهيكلية أو الفلوروفورات الجوهرية كما هو الحال بالنسبة للطرق الفيزيائية الحيوية الأخرى.

ميزة أخرى لهذه التقنية هي أنها تقيس بشكل مباشر درجة حرارة الانتقال الحراري والطاقة المطلوبة لتعطيل التفاعل ، مما يؤدي إلى استقرار البنية الثلاثية للبروتينات. عند استخدامها جنبا إلى جنب مع نشاط التكشف ، يمكن أن تكون درجة حرارة الانتقال الحراري بمثابة معلمة مفيدة لمراقبة الاتساق من الكثير إلى الكثير لعمليات التصنيع للبيولوجيا. يمكن أن يكون العرض المرئي لهذه الطريقة بمثابة وسيط تفاعلي لمساعدة المستخدمين الجدد بشكل فعال في اتخاذ خطوات حاسمة.

للبدء ، قم بتشغيل مسعر المسح التفاضلي. ثم قم بتزويد النيتروجين في النظام. سيؤدي ذلك إلى زيادة الضغط في الخلايا لقمع غليان العينات وكذلك منع تكوين الفقاعات في درجات حرارة مرتفعة.

اعتمادا على المادة المكونة للخلية ، اضبط ضغط إمدادات غاز النيتروجين وفقا للضغط الموصى به من الشركة المصنعة لتجنب إتلاف الخلية. تأكد من ملء جميع خزانات عامل التنظيف بالحجم المطلوب. تشمل عوامل التنظيف المطلوبة منظفات لغسل الخلية والماء لتنظيف الخلية بعد كل عملية عينة.

اضبط درجة حرارة حجرة حمل العينة على قيمة مناسبة ويفضل خمس درجات مئوية للحفاظ على سلامة العينة قبل التجربة. من المهم موازنة العينة مع المخزن المؤقت للتأكد من أن الفرق الوحيد بين المحاليل هو البروتين. لذلك ، يمكن أن يعزى الاختلاف الملحوظ في السعة الحرارية بشكل صحيح إلى البروتين.

تحديد تركيز عينة البروتين باستخدام طريقة مناسبة لتحديد تركيز البروتين مثل طريقة لوري. بالنسبة للأداة المستخدمة في هذا البروتوكول ، فإن نطاق العمل المفضل هو 0.5 إلى ملليغرام واحد من البروتين لكل مليلتر. تحليل العينة بالكسل مقابل المخزن المؤقت الذي سيتم استخدامه كمرجع للتجربة.

قم بإزالة الغاز من العينة والمخزن المؤقت المرجعي في الفراغ للتخلص من الفقاعات الدقيقة التي يمكن أن تسبب عدم دقة الحجم. عند العمل في خزانة الاحتواء الحيوي ذات التدفق الرقائقي، استخدم ماصة دقيقة وأطراف معقمة لتحميل العينات في المخزن المؤقت الخاص بها في أزواج في 96 لوحة بئر. املأ أول زوجين من الآبار بالمخزن المؤقت لإجراء عمليات مسح عازلة للتحقق من ملاءمة الجهاز قبل قياس العينة.

املأ آخر زوجين من الآبار بالماء لمسح المياه لتنظيف الخلايا. ثم قم بتغطية لوحة البئر 96 بغشاء مانع للتسرب. تأكد من إغلاق الآبار بشكل صحيح قبل إخراج اللوحة من خزانة السلامة الحيوية لتجنب تلوث العينة.

أخيرا ، ضع اللوحة في حجرة حمل العينة في الاتجاه الصحيح. باستخدام برنامج الاستحواذ ، أدخل معلومات العينة بالترتيب الذي تم تحميل اللوحة به. أدخل تركيزات البروتين إن وجدت.

خلاف ذلك ، أدخل التركيز في برنامج التحليل قبل تحليل البيانات. حدد الخيار الذي يضمن تنظيف الخلية بالمنظف قبل كل مسح عينة. يجب أن يتبع التنظيف خطوات متعددة للشطف بالماء لضمان عدم ترك أي بقايا منظف في الخلايا.

اضبط درجة حرارة بدء التجربة على 20 درجة مئوية والتي يمكن أن تختلف حسب العينة. بالنسبة للبروتينات المعروفة ، يمكن استخدام درجة حرارة بدء محددة مسبقا بينما يمكن تطبيق درجة حرارة بدء أقل للعينات غير المعروفة. ثم اضبط درجة الحرارة النهائية للتجربة.

قد تختلف درجة الحرارة النهائية أيضا اعتمادا على المعرفة المسبقة بالعينة. بعد ذلك ، قم بتعيين معدل الفحص للتجربة. ينصح بمسح عينات غير معروفة بمعدلات مسح مختلفة لتقييم حركية التكشف.

قم بإعداد برنامج الاستحواذ لإعادة فحص العينات لفحص قابلية انعكاس الانتقال الحراري. يعتبر ظهور البروتين قابلا للعكس إذا كان المحتوى الحراري الذي تم الحصول عليه للفحص الثاني لا يقل عن 80٪ من قيمة المحتوى الحراري من الفحص الأول. اضبط ترموستات ما بعد التجربة على 10 درجات مئوية للحفاظ على سلامة خلية المسعر.

تحقق من صحة معلمات إعداد التجربة قبل تنفيذ التجربة. إذا كان كل شيء في مكانه ، فابدأ التجربة. بعد التجربة، قم بإجراء تحليل البيانات كما هو موضح في بروتوكول النص.

بالنسبة للتحليل ، يتم إجراء طرح خط الأساس يدويا. الاتساق في هذه الخطوة أمر بالغ الأهمية للحصول على نتائج قابلة للمقارنة. تظهر هنا بيانات أولية تمثيلية لتشغيل تجريبي بما في ذلك المخزن المؤقت ومسح المياه.

العينات التي يتم تحليلها هي سموم في حالاتها الأصلية وخالية من السموم. تتم معالجة عمليات مسح العينات بشكل منفصل لاشتقاق درجة حرارة الانصهار وقيم المحتوى الحراري لكل عينة. بالنسبة للدولة الأصلية ، تبلغ درجة حرارة الانصهار 55.55 درجة مئوية والمحتوى الحراري للسم 3.157 في 10 إلى خمس سعرات حرارية لكل مول.

على العكس من ذلك ، فإن درجة حرارة انصهار السم في حالته الخالية من السموم هي 81.21 درجة مئوية والمحتوى الحراري 3.656 في 10 إلى خمس سعرات حرارية لكل مول. يوضح تراكب البيانات المعالجة للسم في حالته الأصلية وإزالة السموم أن العينة التي تم إزالة السموم أكثر استقرارا حراريا من حالتها الأصلية وفقا لقيم درجة حرارة الانصهار. كما يشير إلى أن عملية إزالة السموم تدخل تغييرات هيكلية في الهيكل الثلاثي للسام.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر توفير إمدادات كافية من المنظفات والماء لمنع التلوث المتبادل للخلية والحقنة لأن وضوحها أمر بالغ الأهمية للحصول على نتائج دقيقة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، سيكون لديك فهم جيد لمسعر المسح التفاضلي كطريقة لتقييم الاستقرار الحراري وتشكيل البروتينات. يجب أن تكون قادرا أيضا على إجراء خصومات ذات مغزى من عمليات التشغيل الحراري الناتجة.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل ازدواج اللون الدائري من أجل الإجابة على أسئلة إضافية تتعلق بالتغييرات التي تطرأ على الهياكل الثانوية أثناء التكشف. تم استخدام البيانات التي تم جمعها لمجموعة من الكثير من نفس المنتج لإنشاء خطوط أساس تجريبية لفحص تأثير تغييرات العملية وظروف الصياغة والتخزين على تكوين بنية مستضدات البروتين لإنتاج اللقاح.