الجينوم التحرير وإخراج تمايز hPSCs عن التحقيق مع محددات النسب في تنمية البنكرياس الإنسان

يوضح هذا البروتوكول كيفية إنشاء منصة iCRISPR للتحرير السريع للجينوم في hPSCs ، وكيفية دمج الخطوط المعدلة بالجينوم مع تمايز البنكرياس الموجه ب hPSC لدراسة تطور البنكرياس البشري وأمراضه. يمكن أن تساعد هذه الطرق في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال نمو البنكرياس البشري ، مثل التحكم الجيني في نمو البنكرياس الطبيعي ، والأساس الجزيئي لمرض السكري. الميزة الرئيسية لهذه التقنيات هي أنها تسمح لنا بتعديل الجينات ذات الأهمية في hPSCs بكفاءة واستخدام خطوط الخلايا المعدلة هذه لدراسات تطور البنكرياس البشري والأمراض في المختبر.

استزراع hPSCs في ظروف محددة كيميائيا وخالية من المغذيات على أطباق بشرية مقطوعة ومغلفة بالفيترونكتين. في اليوم السابق للتثقيب الكهربائي ، أضف 10 مثبطات ميكرومولار ROCK أثناء تغيير الوسائط. في يوم التثقيب الكهربائي ، قم بإعداد أطباق مغلفة بالفيترونكتين مقدما

ثم قم بإزالة وسط الثقافة من الخلايا ، واغسلها مرة واحدة باستخدام PBS بدون الكالسيوم والمغنيسيوم ، ثم عالج الخلايا بكاشف تفكك 1X عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق تقريبا. بعد ذلك ، قم بشفط كاشف التفكك قبل انفصال الخلايا وأضف 10.5 مل من الوسط الكامل. استخدم سحب العينات اللطيف لتشكيل تعليق أحادي الخلية قبل نقله إلى أنابيب أجهزة الطرد المركزي.

قم بإجراء عد الخلايا على 500 ميكرولتر من تعليق الخلايا باستخدام عداد خلية آلي. ثم قم بتكمير hPSCs عند 200 مرة G لمدة خمس دقائق. أعد تعليق الخلايا في PBS البارد عند 12.5 مرة 10 إلى الخلايا السادسة لكل مليلتر ، وقم بتحويلها إلى أحجام 800 ميكرولتر.

أضف البلازميدات إلى كل تعليق hPSC سعة 800 ميكرولتر واخلطه جيدا. انقلي الخليط إلى كوفيت كهربائي بحجم 0.4 سم ، واتركيه على الثلج لمدة خمس دقائق تقريبا. قم بتزويد الخلايا بالكهرباء باستخدام نظام التثقيب الكهربائي عند 250 فولت و 500 ميكروفاراد.

من الأهمية بمكان استخدام hPSCs صحية ومتاثرة لتحرير الجينوم. بعد التثقيب الكهربائي ، انقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر مع خمسة ملليلتر من الوسط الكامل الدافئ مسبقا ، ثم قم بتكسير الخلايا. أعد تعليق الخلايا في 10 ملليلتر من الوسط الكامل باستخدام 10 مثبطات ميكرومولار ROCK ، والصفيحة واحدة في 10 إلى السادسة ، و 2.5 مرة 10 إلى السادس ، وخمسة أضعاف 10 إلى الخلايا السادسة من كل ثقب كهربائي على أطباق مغلفة بفيتامين ، لذلك سيكون لواحد على الأقل من الألواح مستعمرات وحيدة الخلية كافية للقطف.

زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية. في اليوم الثاني ، ابدأ اختيار النيومايسين بإضافة وسيط يحتوي على 500 ميكروغرام لكل مليلتر من كبريتات G418. في اليوم السادس، ابدأ اختيار بورومايسين بإضافة وسيط يحتوي على ميكروغرام واحد لكل مليلتر من بيرومايسين ثنائي هيدروكلوريد.

في الأيام من 10 إلى 12 ، سيصل قطر مستعمرات الخلية المفردة hPSC إلى ملليمتر إلى ملليمترين. في هذه المرحلة ، اختر من 12 إلى 24 مستعمرة تحت مجهر مجسم. قم بتقسيم مستعمرات hPSC ميكانيكيا إلى قطع صغيرة باستخدام طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر ، وانقل الخلايا مباشرة إلى ألواح 24 بئرا مطلية بفيتامين برونكتين.

قبل 24 ساعة من تعداء الحمض النووي الريبي الموجه ، عالج iCas9 hPSCs بميكروغرامين لكل مليلتر من الدوكسيسيكلين. في يوم التعداء ، قم بإعداد ألواح 24 بئرا مغلفة بفيتامين وفصل خلايا iCas9 إلى خلايا مفردة باستخدام كاشف التفكك 1X كما كان من قبل. بعد ذلك ، قم بتكبيل الخلايا عند 200 مرة G لمدة خمس دقائق وأعد تعليق الخلايا عند 0.5 في 10 إلى الخلايا السادسة لكل مليلتر في وسط كامل مكمل بميكروغرامين لكل مليلتر من الدوكسيسيكلين و 10 ميكرومولار ROCK مثبط.

صفيحة 500 ميكرولتر من الخلايا المعلقة في آبار فردية من اللوحة المكونة من 24 بئرا. لكل دليل RNA ، قم بعمل مخاليط التعداء التالية. امزج أ ، 50 ميكرولتر من وسط المصل المخفض بالإضافة إلى ميكرولتر واحد من الحمض النووي الريبي التوجيهي.

امزج ب ، 50 ميكرولتر من وسط المصل المخفض بالإضافة إلى ثلاثة ميكرولترات من كاشف النعال. يمزج المزيج A و B لعمل خليط سعة 100 ميكرولتر ويحتضن لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. أضف 50 ميكرولترا من الخليط إلى الخلايا الموجودة في الآبار المكررة للوحة المكونة من 24 بئرا واخلطها جيدا.

بعد أربعة أيام ، استخرج الحمض النووي الجيني ، وتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل المناطق المستهدفة التي تحيط بتسلسلات استهداف الحمض النووي الريبي الإرشادي ، وتقدير كفاءة التحرير باستخدام هضم T7E1. ابدأ في تمايز خطوط hPSC عندما تصل الخلايا إلى 80٪ من التقاء بعد يومين من البذر. أضف وسيط يوم التمايز صفر ثم قم بتغيير الوسائط يوميا باستخدام الصيغ الموضحة هنا.

في اليوم 10 ، افحص علامات PP2 السلفية البنكرياسية اللاحقة ، PDX1 ، و NKX6.1 عن طريق تلطيخ مجموعة فرعية من الخلايا الفلورية المناعية. ثم انتقل إلى ثقافة واجهة الهواء والسائل عن طريق معالجة خلايا PP2 أولا بمثبطات ROCK 10 ميكرومولار لمدة أربع ساعات. بمجرد انقضاء وقت الحضانة ، قم بفصل الخلايا كما كان من قبل.

تقليل مدة معالجة كاشف التفكك لزيادة بقاء الخلية إلى أقصى حد للبذر في مرحلة التمايز بين الواجهة بين الهواء والسائل. استنشق كاشف التفكك قبل انفصال الخلايا. ثم أضف 10 ملليلتر من وسط boo-lah إلى اللوحة وقم بتفريق خلايا PP2 في خلايا مفردة عن طريق سحب العينة برفق لأعلى ولأسفل.

اجمع معلق الخلية الواحدة. عد رقم الخلية ، وحبيبات الخلايا. بعد إعادة تعليق حبيبات الخلية في وسط التمايز S5 ، ضع خمسة إلى 10 ميكرولترات من الخلايا لكل بقعة على مرشح إدراج الآبار.

أضف وسيط S5 إلى الجزء السفلي من كل إدراج transwell واحتضنه مع تغييرات الوسائط حتى يمكن اكتشاف علامات الغدد الصماء في البنكرياس عن طريق تلطيخ الفلورسنت المناعي. يوضح هذا الشكل انضمام نهاية غير متماثلة بوساطة iCRISPR في hPSCs. تعتبر خروج المغلوب الجيني عالية الكفاءة ، حيث لا توجد عملية اختيار متضمنة ، ويمكن تحقيق 20٪ إلى 50٪ من الطفرات ثنائية الأليل.

للحصول على تعديلات جينية فعالة ودقيقة ، يتم ربط الحمض النووي الريبي الإرشادي مع متبرع بالحمض النووي أحادي الشريطة يحمل تغيير التسلسل المحدد ، كما هو موضح باللون الأحمر. في كثير من الأحيان ، لمنع إعادة القطع في الأليلات المعدلة ، يوصى بتضمين طفرة صامتة في تسلسل PAM ، كما هو موضح هنا باللون الأخضر. باستخدام هذا النظام ، يمكن تحقيق ما يقرب من 10٪ من المستنسخة التي تحمل تعديل الجينوم المطلوب بوساطة الإصلاح الموجه بالتماثل ، دون تعديلات إضافية في كلا الأليلين.

بمجرد إتقانها ، يستغرق الأمر أقل من شهرين لإنشاء خط iCas9 hPSC جديد. بعد ذلك ، يمكن إنشاء مجموعة متنوعة من خطوط مستعمرة hPSC الطافرة في غضون شهر إلى شهرين. بعد توليد الخطوط الطافرة الجينية hPSC ، يسمح لنا التمايز التدريجي في المختبر لخطوط الخلايا الطافرة إلى خلايا شبيهة ببيتا البنكرياس بدراسة الخطوات التنموية المحددة المتأثرة بهذه الطفرات ، والتي ستسمح بفهم أفضل لآليات المرض الأساسية.