إجراء شامل لتقييم في فيفو الأداء من السرطان طب النانو

الهدف العام من هذا الإجراء هو تقييم السلوك في الجسم الحي للأدوية النانوية للسرطان على المستويات الجهازية والأنسجة والخلية المفردة وتحت الخلوية في الفئران الحاملة للورم والكفاءة المناعية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على السؤال الرئيسي في مجال الطب النانوي للسرطان. كيف تتراكم الأدوية النانوية كميا في الأنسجة المختلفة للحيوانات الحية بمرور الوقت؟

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن نهج الملصقات المزدوجة هذا يسمح بتوصيف الطب النانوي في الجسم الحي من المستوى العياني إلى المستوى المجهري. نختار الجسيمات الشحمية كمثال لإزالة إجراءاتنا لأن الجسيمات الشحمية قيد الاستخدام السريري حاليا ، وهي أيضا منصة شائعة للأدوية النانوية التجريبية. لبدء الإجراء ، قم بإذابة 20 ملليغرام من خليط الدهون ، والتي تشمل 0.1٪ بواسطة شامة من صبغة الفلورسنت الموجبة المحبة للدهون ومليلترين من الكلوروفورم.

ثم جفف الدهون باستخدام مبخر دوار. أضف 20 مل من المحلول الملحي المخزن بالفوسفات إلى الدهون المجففة. قم بتقطيع الخليط على الثلج باستخدام مكبر صوتي مسبار 3.8 ملم عند 30 واط لمدة 30 دقيقة ، مع الحفاظ على الخليط بين أربع و 20 درجة مئوية طوال الوقت.

جهاز الطرد المركزي لتعليق الجسيمات النانوية الشحمية الناتجة عند 4 ، 000 جم لمدة 10 دقائق. تخلص من الحبيبات واغسل الجسيمات الشحمية باستخدام PBS ، باستخدام وحدة مرشح الطرد المركزي MWCO 100 كيلو دالتون عند 4000 جم ، انقل الجسيمات الشحمية المركزة من الغرفة العلوية إلى أنبوب طرد مركزي جديد. يمكن تخزين الجسيمات الشحمية في PBS في الثلاجة لمدة تصل إلى أسبوع واحد.

قم بإجراء تشتت الضوء الديناميكي على خليط من 50 ميكرولترا من معلق الجسيم الشحمي المنقى و 950 ميكرولتر من PBS. قياس أحجام الجسيمات وتحديد توزيع الحجم. لبدء إجراء الملصقات الإشعاعية ، انقل إلى أنبوب سعة 1.5 مليلتر ، الحجم المطلوب من الجسيمات الشحمية المنقاة و PBS ، للحصول على ملليغرامين من الدهون.

أضف إلى هذا مليكوري من أكسالات الزوركونيوم 89 للحصول على حجم نهائي يبلغ 100 ميكرولتر ودرجة حموضة من 6.9 إلى 7.1. يقلب المزيج على حرارة 37 درجة مئوية لمدة ساعتين. بعد ذلك ، قم بإزالة الزركونيوم 89 الحر عن طريق ترشيح الطرد المركزي باستخدام وحدة مرشح 100 كيلودالتون عند 4 ، 000 جم ، اغسل المحتبس باستخدام PBS معقم ثلاث مرات عند 4 ، 000 جم ، ثم قم بتخفيف الاحتباس إلى حوالي ثلاثة ميكروكوري لكل ميكرولتر للحقن.

استخدم HPLC الذي يستبعد الحجم مقترنا بكاشف إشعاعي لتحديد النقاء الكيميائي الإشعاعي للجسيمات الشحمية ذات العلامات الإشعاعية. إذا كان النقاء الكيميائي الإشعاعي أقل من 95٪ ، فأعد صياغة الجرعة. استخدم تشتت الضوء الديناميكي للتأكد من أن حجم الجسيمات وقيم التوزيع متشابهة مع تلك الموجودة في الجسيمات الشحمية غير المصنفة بالإشعاع.

لبدء إجراء التصوير ، قم بحقن حوالي 300 ميكروكوري من الجسيمات الشحمية ذات العلامات المشعة في الوريد الذيل لفأر الورم الميلانيني المقيد. بعد دقيقتين من الحقن، استخدم حقنة أنسولين قياس 28 لجمع 10 إلى 20 ميكرولترا من الدم من وريد ذيل الفأر. انقل عينة الدم إلى أنبوب عد موزون مسبقا.

قم بوزن عينة الدم وقياس النشاط بعداد جاما. احسب تركيز النشاط الإشعاعي كنسبة مئوية من الجرعة المحقونة لكل جرام. بعد خمس عشرة دقيقة من الحقن ، اجمع عينة دم أخرى وقياسها بنفس الطريقة.

بعد ذلك ، قم بتخدير الفأر عن طريق إعطاء 2٪ من الأيزوفلوران والأكسجين عن طريق مخروط الأنف. جمع وقياس عينة دم ثالثة بعد ساعة واحدة من الحقن. بعد ذلك ، اسمح للفأر بالتعافي في قفص الاسترداد حتى يتم استعادة الحركة الطبيعية.

جمع عينات إضافية بعد أربع وثماني ساعات و24 و 48 ساعة من الحقن. اسمح للفأر بالتعافي تماما بين الحقن. ضع الفأر في غرفة مخصصة للحيوانات التي تم إعطاء المواد المشعة لها.

بعد 24 أو 48 ساعة من حقن الجسيم الشحمي ، قم بتخدير الفأر بنسبة 2٪ من الأيزوفلوران والأكسجين. ضع الماوس على بطنه على سرير ماسح ضوئي صغير للحيوانات الصغيرة. استمر في توصيل 2٪ من الأيزوفلوران والأكسجين عبر مخروط الأنف.

ضع مرهما بيطري على عيون الفأر لمنعها من الجفاف. ثم انقل سرير الماسح الضوئي إلى الجهاز. قم بإجراء فحص ثابت للجسم بالكامل لمدة 15 دقيقة مع ما لا يقل عن 50 مليون حدث متزامن ، بطاقة تتراوح من 250 إلى 700 كيلو إلكترون فولت ، ونافذة توقيت مصادفة مدتها ستة نانو ثانية.

بعد ذلك ، قم بإجراء فحص بالأشعة المقطعية لمدة خمس دقائق مع 120 خطوة دورانية على 220 درجة ، مع ما يقرب من 145 مللي ثانية لكل إطار. بعد الانتهاء من المسح ، قم بالتضحية بالفأر على الفور عن طريق اختناق ثاني أكسيد الكربون. تأكد من الموت عن طريق الضغط على مخلب ، ثم قم بإجراء خلع عنق الرحم.

قم بتنقية الأنسجة باستخدام PBS لإزالة الدم ، وحصاد عينات الأنسجة ذات الصلة. قم بوزن الأنسجة التي تم جمعها وقياس نشاطها. احسب تراكم الجسيمات الشحمية الموسومة بالإشعاع في الأنسجة كنسبة مئوية من الجرعة المحقونة لكل جرام.

قم بتخزين أنسجة الورم في PBS بارد. قم بإجراء قياس التدفق الخلوي خارج الجسم الحي وتصوير التدفق المناعي على أنسجة الورم المحصودة لقياس التراكم فيما يتعلق بمجموعات الخلايا. أظهر التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني / التصوير المقطعي المحوسب للفئران الحاملة للورم التي تم حقنها بجسيمات نانوية تحمل علامة الزركونيوم -89 تراكما كبيرا للجسيمات النانوية في أنسجة الورم بعد 24 ساعة من الحقن.

تم تحديد عمر النصف في الدم للجسيمات النانوية ليكون حوالي 10 ساعات. كانت قياسات التوزيع الأحيائي خارج الجسم الحي بعد 24 ساعة من الحقن متسقة مع قياسات التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني / التصوير المقطعي المحوسب في الجسم الحي. ثم تم فحص تراكم الجسيمات النانوية على مستوى الخلية المفردة باستخدام تقنيات التلوين المناعي.

أشار قياس التدفق الخلوي إلى أنه تم العثور على الجسيمات النانوية تتراكم بشكل تفضيلي في الضامة بمساعدة الورم. أشار التصوير المناعي لعينات الورم أيضا إلى استهداف محدد للخلايا البطانية بواسطة الجسيمات النانوية. يمكن أن تساعد هذه التقنية الباحثين في تحديد الأدوية النانوية الواعدة للترجمة السريرية.

بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في غضون ثلاثة أيام إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. عند وضع العلامات الإشعاعية على الأدوية النانوية ، من المهم تطبيق معايير عالية لمراقبة الجودة. بعد هذا الإجراء ، يمكن تسمية الأدوية النانوية الأخرى ، مثل المستحلبات النانوية ، والجسيمات النانوية البوليمرية ، والمذيلات ، والأجسام المضادة ، وشظايا الأجسام المضادة ، من أجل قياس أدائها في الجسم الحي في الفئران الحاملة للورم.