إجراء شامل لتقييم

الهدف العام من هذا الإجراء هو تقييم سلوك الأدوية النانوية لعلاج السرطان داخل الجسم الحي على المستويات الجهازية، والنسيجية، ومستوى الخلية الواحدة، والمستويات دون الخلوية في الفئران ذات الكفاءة المناعية والحاملة للأورام. ويمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على السؤال الجوهري في مجال الأدوية النانوية لعلاج السرطان: كيف تتراكم الأدوية النانوية كمياً في أنسجة مختلفة من الحيوانات الحية بمرور الوقت؟

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أن نهج الوسم المزدوج هذا يسمح بتوصيف النانو-طب في الجسم الحي من المستوى العياني إلى المستوى المجهري. لقد اخترنا الليبوزومات كمثال لتوضيح الإجراء الخاص بنا لأن الليبوزومات مستخدمة حالياً في التطبيقات السريرية، كما أنها تمثل منصة شائعة للأدوية النانوية التجريبية. لبدء الإجراء، قم بإذابة 20 milligrams من خليط دهني، يتضمن 0.1% by mole من صبغة فلورية كاتيونية محبة للدهون، في اثنين milliliters من الكلوروفورم.

بعد ذلك، يتم تجفيف الدهون باستخدام المبخر الدوار. أضف 20 milliliters من المحلول الملحي المنظم بالفوسفات إلى الدهون المجففة. قم بمعالجة الخليط بالموجات فوق الصوتية على الثلج باستخدام مسبار سونيكاتور بقطر 3.8 millimeter وبقدرة 30 watts لمدة 30 minutes، مع الحفاظ على درجة حرارة الخليط بين 4 و20 degrees Celsius طوال العملية.

قم بطرد معلق الجسيمات النانوية الليبوزومية الناتج باستخدام جهاز الطرد المركزي عند 4,000 G لمدة 10 دقائق. تخلص من الراسب واغسل الليبوزومات باستخدام PBS، وذلك باستخدام وحدة ترشيح طرد مركزي بحد قطع للوزن الجزيئي (MWCO) يبلغ 100 kilodalton عند 4000 G. انقل الليبوزومات المركزة من الحجرة العلوية إلى أنبوب طرد مركزي جديد. يمكن تخزين الليبوزومات في PBS في الثلاجة لمدة تصل إلى أسبوع واحد.

أجرِ تشتت الضوء الديناميكي على خليط مكون من 50 µL من معلق الليبوزومات المُنقى و 950 µL من PBS. قم بقياس أحجام الجسيمات وتحديد توزيع الحجم. لبدء إجراء الوسم الإشعاعي، انقل إلى أنبوب سعة 1.5 mL الحجم المطلوب من الليبوزومات المُنقى و PBS، للحصول على 2 mg من الليبيدات.

أضف إلى ذلك واحد millicurie من أوكسالات zirconium-89 للوصول إلى حجم نهائي قدره 100 µL وبدرجة pH تتراوح من 6.9 إلى 7.1. حرك الخليط عند درجة حرارة 37 °C لمدة ساعتين. بعد ذلك، قم بإزالة zirconium-89 الحر عن طريق الترشيح المركزي باستخدام وحدة ترشيح 100 kDa عند 4,000 ×g. اغسل الراشح المحتجز بـ PBS معقم ثلاث مرات عند 4,000 ×g. ثم خفف الراشح المحتجز إلى تركيز يقارب ثلاثة microcurie لكل µL من أجل الحقن.

استخدم تقنية HPLC القائمة على استبعاد الحجم مقترنة بكاشف إشعاعي لتحديد النقاوة الكيميائية الإشعاعية للليبوزومات المسمى إشعاعياً. إذا كانت النقاوة الكيميائية الإشعاعية أقل من 95%، فأعد تحضير الجرعة. استخدم تشتت الضوء الديناميكي للتأكد من أن قيم حجم الجسيمات وتوزيعها مشابهة لتلك الخاصة بالليبوزومات غير المسمى إشعاعياً.

لبدء إجراء التصوير، احقن حوالي 300 microcurie من الليبوزومات المحددة إشعاعياً في الوريد الذيلي لفأر مصاب بالميلانوما ومقيد. بعد دقيقتين من الحقن، استخدم حقنة إنسولين قياس 28 gauge لجمع 10 إلى 20 µL من الدم من الوريد الذيلي للفأر. انقل عينة الدم إلى أنبوب عدّ موزون مسبقاً.

قم بوزن عينة الدم وقياس النشاط الإشعاعي باستخدام عداد غاما. احسب تركيز النشاط الإشعاعي كنسبة مئوية من الجرعة المحقونة لكل جرام. بعد مرور خمس عشرة دقيقة على الحقن، قم بجمع عينة دم أخرى وقياسها بنفس الطريقة.

بعد ذلك، يتم تخدير الفأر عن طريق إعطاء 2% isoflurane وأكسجين عبر قناع أنفي. تُجمع عينة دم ثالثة وتُقاس بعد ساعة واحدة من الحقن. ثم يُترك الفأر ليتعافى في قفص التعافي حتى يستعيد قدرته الطبيعية على الحركة.

اجمع عينات إضافية بعد أربع وثمانٍ و24 و48 ساعة من الحقن. اترك الفأر ليتعافى تماماً بين عمليات الحقن. ضع الفأر في غرفة مخصصة للحيوانات التي حُقنت بمواد مشعة.

بعد مرور 24 أو 48 ساعة من حقن الليبوزومات، يتم تخدير الفأر باستخدام 2%isoflurane والأكسجين. يوضع الفأر على بطنه على سرير ماسح microPET-CT للحيوانات الصغيرة. ويستمر إمداد 2%isoflurane والأكسجين عبر قناع أنفي.

ضع مرهمًا بيطريًا في عيني الفأر لمنع جفافهما. بعد ذلك، حرك سرير الماسح الضوئي إلى داخل الجهاز. أجْرِ مسحًا ثابتًا للتصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني (PET) للجسم بالكامل لمدة 15 دقيقة، بحيث يتم تسجيل ما لا يقل عن 50 مليون حدث متزامن، بطاقة تتراوح من 250 إلى 700 kiloelectron volts، ونافذة توقيت تزامن تبلغ ست nanoseconds.

بعد ذلك، قم بإجراء فحص بالأشعة المقطعية (CT scan) لمدة خمس دقائق مع 120 خطوة دورانية على مدى 220 درجة، وبمعدل 145 milliseconds تقريبًا لكل إطار. بعد اكتمال الفحص، قم بالتضحية بالفأر فورًا عن طريق الاختناق بثاني أكسيد الكربون. تأكد من الوفاة عن طريق قرص مخلب الحيوان، ثم قم بإجراء خلع الرقبة.

يتم تروية الأنسجة باستخدام PBS لإزالة الدم، ثم يتم جمع عينات الأنسجة ذات الصلة. تُوزن الأنسجة المجمعة ويُقاس نشاطها الإشعاعي. يتم حساب تراكم الليبوزومات المسمى إشعاعياً في الأنسجة كنسبة مئوية من الجرعة المحقونة لكل جرام.

يُحفظ نسيج الورم في محلول PBS بارد. يُجرى تحليل التدفق الخلوي (flow cytometry) والتصوير المناعي الفلوري خارج الجسم (ex vivo) على نسيج الورم الذي تم استئصاله لقياس التراكم بالنسبة للمجموعات الخلوية. وقد أظهر تصوير PET/CT للفئران الحاملة للأورام والتي حُقنت بجسيمات نانوية موسومة بالزركونيوم-89 تراكمًا ملحوظًا للجسيمات النانوية في نسيج الورم بعد 24 ساعة من الحقن.

تحدّد عمر النصف للجسيمات النانوية في الدم بنحو 10 ساعات. وكانت قياسات التوزيع الحيوي خارج الجسم (Ex vivo) بعد 24 ساعة من الحقن متوافقة مع قياسات التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني/التصوير المقطعي المحوسب (PET/CT) داخل الجسم (in vivo). بعد ذلك، تم استقصاء تراكم الجسيمات النانوية على مستوى الخلية الواحدة باستخدام تقنيات التلوين المناعي.

أشار قياس التدفق الخلوي إلى أن الجسيمات النانوية تتراكم بشكل تفضيلي في البلاعم المرتبطة بالأورام. كما أظهر التصوير المناعي الفلوري لعينات الأورام استهدافًا محددًا للخلايا البطانية بواسطة الجسيمات النانوية. ويمكن لهذه التقنية أن تساعد الباحثين في تحديد الأدوية النانوية الواعدة للتطبيق السريري.

بمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون ثلاثة أيام إذا طُبقت بشكل صحيح. وعند إجراء الوسم الإشعاعي للأدوية النانوية، من المهم تطبيق معايير عالية لضبط الجودة. وباتباع هذا الإجراء، يمكن وسم أدوية نانوية أخرى، مثل المستحلبات النانوية، والجسيمات النانوية البوليمرية، والمذيلات، والأجسام المضادة، وشظايا الأجسام المضادة، وذلك لقياس أدائها الحيوي في الفئران الحاملة للأورام.