نظام لفعالية والسمسة فحص مثبطات استهداف بين الخلايا المتفطرة السلية

لقد قمنا بتطوير نظام الفحص الإنتاجية العالية وحدات لاكتشاف مركبات جديدة ضد السل المتفطرة، تستهدف داخل وفي مرق تزايد البكتيريا وكذلك السمية الخلوية ضد الخلية المضيفة الثدييات.

الهدف العام لهذا البروتوكول هو تقديم تقييم متعدد الأبعاد لكيفية تأثير المركبات على بقاء المتفطرة السلية داخل البلاعم البشرية. تتمحور هذه الطريقة حول مقايسة الفعالية المستندة إلى لوسيفيراز. عند دمجها مع السمية الخلوية ، يمكن لمقايسة MIC أن توفر معلومات مفيدة حول تعديل مركبات HIT في تطوير أدوية السل.

الميزة الرئيسية لطريقتنا هي أنها توفر الوقت والعمالة. إنه يستبدل مقايسة وحدة تشكيل مستعمرة CFU بفحص قائم على Luciferase. بشكل عام ، سيعاني الأفراد الجدد في هذه التقنية من أجل الاتساق مع سحب العينات اليدوية بدلا من الأتمتة.

تعد تقنية سحب العينة المتسقة أمرا بالغ الأهمية. تنمو خلايا THP1 في RPMI في وسط كامل. مع الحفاظ على كثافة خلية تتراوح من 0.2 إلى مليون خلية لكل مليلتر من الوسط بين الممرات.

استخدم مقياس الطيف الضوئي لقياس OD600 لمعلق بكتيري ينمو بنشاط. ثم احسب الكثافة البكتيرية باستخدام عامل التحويل 0.1 OD600 يساوي ثلاثة أضعاف 10 أس البكتيريا السابعة لكل مليلتر. ماصة ما يكفي من البكتيريا لوزارة الداخلية من 10 إلى واحد في أنبوب طرد مركزي جديد.

ثم حبيبات البكتيريا في 3 ، 000 مرة جم لمدة 10 دقائق. لمعالجة البكتيريا ، أضف 50 ميكرولترا من المصل البشري إلى 450 ميكرولتر من RPMI 1640 واستخدمه لإعادة تعليق الحبيبات البكتيرية بكثافة واحدة في 10 إلى البكتيريا الثامنة لكل 500 ميكرولتر من المتوسط. اترك الخليط يحتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.

بعد ذلك ، باستخدام مقياس كثافة الدم والمجهر المقلوب ، حدد كثافة ثقافة الخلايا THP1. ثم ، في أنابيب الطرد المركزي المعقمة ، قم بتكسير الخلايا عند 100 مرة G في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. استنشق المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في RPMI في وسط كامل بكثافة مليون خلية لكل مليلتر.

أضف PMA إلى التركيز النهائي البالغ 40 نانوغرام لكل ملليلتر. هذا هو مزيج التمايز. مزيج من مرض السل المتضاد مع مزيج تمايز THP1 في وزارة الداخلية من 10 إلى واحد.

وقم بتقطيع المزيج النهائي عند 100 ميكرولتر لكل بئر في صفيحة مسطحة بيضاء 96 جيدا. ثم اسمح للتمايز والعدوى بالحضانة عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة تحتوي على 5٪ ثاني أكسيد الكربون بين عشية وضحاها. في اليوم التالي ، استخدم 100 ميكرولتر من RPMI لغسل الآبار مرتين.

ثم أضف المركبات المخففة إلى التركيزات المطلوبة و RPMI في وسط كامل. احتضن الأطباق لمدة ثلاثة أيام. عند استخدام الماصات متعددة القنوات، تذكر أن تمارس حركة المكبس البطيئة والثابتة ودائما ما تهبط أطراف الماصة في نفس المكان داخل كل بئر لتقليل الاضطراب الذي يلحق بخلايا THP1.

بعد الحضانة ، قم بشفط الوسط من الآبار وأضف 50 ميكرولترا من كاشف فحص لوسيفيراز إلى كل بئر. ثم استخدم سدادات الألواح اللاصقة الشفافة لإغلاق الألواح. احتضن الألواح عند 22 درجة مئوية لمدة خمس دقائق ، ثم استخدم مقياس الإضاءة للحصول على قراءة بمعدل ثانية واحدة لكل بئر.

للتمييز بين خلايا THP1 ، بعد تحضير مزيج التمايز كما هو موضح سابقا في هذا الفيديو ، قم بتوزيع 100 ميكرولتر من مزيج التمايز في كل بئر من صفيحة واضحة من الخلايا 96 بئر. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون طوال الليل. في اليوم التالي ، قم بشفط الوسط من الآبار واستخدم RPMI 1640 لغسلها مرتين.

أضف 100 ميكرولتر من المركبات المخففة في RPMI غير مكتملة إلى الآبار. ثم احتضان الخلايا لمدة ثلاثة أيام. قم بإذابة 0.5 جرام من MTT في 100 مل من PBS لعمل محلول مخزون من خمسة ملليغرام لكل مليلتر.

ثم تصفية تعقيم المحلول. قبل ساعتين ونصف من نهاية فترة الحضانة التي تبلغ ثلاثة أيام ، أضف 25 ميكرولترا من محلول MTT إلى كل بئر من الخلايا وأكمل فترة الحضانة. تحضير 50٪ NN ثنائي ميثيل فورماميد أو DMF عن طريق خلط 250 مل من DMF مع 250 مل من الماء منزوع الأيونات.

قم بإعداد المخزن المؤقت لاستخراج MTT على النحو التالي. ضع 100 جرام من SDS في زجاجة سعة 500 مل وأضف 300 مل من 50٪ DMF. ضع حرارة منخفضة للسماح ل SDS بالذوبان.

أضف 10 مل من حمض الخليك النقي و 12.5 مل من حمض الهيدروكلوريك المولاري. ثم استخدم 50٪ DMF لملء الزجاجة حتى علامة 500 ملليلتر. في نهاية فترة المعالجة ، أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للاستخراج إلى كل بئر.

احتضان الخليط عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة تحتوي على 5٪ ثاني أكسيد الكربون طوال الليل. في اليوم التالي ، اقرأ الامتصاص عند 570 نانومتر. لإجراء فحص ريزازورين ، قم بزراعة مرض السل في 7H9 ADST إلى مرحلة منتصف الطريق.

قم بتخفيف المزرعة باستخدام 7H9 ADST إلى OD600 من 0.01. استخدم 7H9 ADST لتخفيف المركبات إلى ضعف تركيزات الاختبار. وتناول 100 ميكرولتر من كل مركب مخفف في كل بئر من صفيحة بئر 96 واضحة.

انقل 100 ميكرولتر من المعلق البكتيري المخفف إلى كل بئر. احتضان الصفائح عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة لمدة خمسة أيام. قم بإذابة 10 ملليغرام من الريزازورين في 100 مل من الماء منزوع الأيونات.

وتصفية تعقيم المحلول. أضف 30 ميكرولتر من محلول الريزازورين إلى الآبار. ثم احتضان الخلايا لمدة 48 ساعة.

يشار إلى نمو البكتيريا من خلال تحويل اللون من الأزرق إلى الوردي. إجراء التحليل الكمي وفقا لبروتوكول النص. يوضح هذا المخطط المبعثر بيانات التلألؤ الخام المقاسة بوحدات التلألؤ النسبية لمعالجة التركيزات المختلفة من ريفامبيسين على خلايا M.tuberculosis و THP1.

في هذه المؤامرة ، تظهر النسبة المئوية للانخفاض واللألؤ في الآبار المعالجة مقارنة بالآبار غير المعالجة. ريفامبيسين قادر على تقليل 99.9٪ من وحدات الضوء النسبي ، أو RLUs من M.tuberculosis داخل الخلايا بتركيز 0.1 ميكروغرام لكل مليلتر. على غرار النتائج المنشورة سابقا التي تم تحديدها من CFU.

في هذا الشكل ، يتم توضيح السمية الخلوية الناتجة عن زيادة تركيزات G1-1H المستخدمة في اختبار MTT. من الواضح أن تركيزات 10 وثلاثة ميكرومولار أقل من قطع IC 50. يوضح هذا الشكل تأثيرات التركيزات المختلفة للمضاد الحيوي أبراميسين على تحويل الريزازورين بواسطة M.tuberculosis.

كان MIC90 في المرق بين 2.5 وخمسة ميكروغرام لكل ملليلتر. هذا أعلى قليلا من القيمة المنشورة سابقا البالغة 1.5 ميكروغرام لكل ملليلتر. لكنها لا تزال ضمن النطاق المقبول.

كما هو موضح هنا ، يصبح التبخر مهما لجميع التجارب ذات أوقات الحضانة الطويلة. لذلك يجب توخي الحذر للحفاظ على الحاضنات رطبة جيدا لتجنب التناقضات. بمجرد إتقانها ، يمكن أن توفر هذه التقنية بيانات موثوقة داخل الخلايا في أقل من أربعة أيام.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن تكون لطيفا مع خلايا THP1 ، وأن تكون متسقا مع سحب العينات إذا حاولت بدون أتمتة. باتباع هذا الإجراء ، يمكن استخدام طرق أخرى مثل الفحص عالي المحتوى لتحديد ما إذا كانت المركبات الضاربة مضادة للجراثيم أو مبيدات للجراثيم. بعد تطويره ، مهد هذا البروتوكول الطريق للباحثين في مجال اكتشاف أدوية السل لتقييم فعالية المركب بسرعة ضد MTB داخل الضامة البشرية.

لا تنس أن العمل مع بكتيريا السل الدقيقة أمر خطير. استخدم الاحتياطات والمعدات المناسبة عند التعامل مع هذه الكائنات الحية الدقيقة.