نظام لفعالية والسمسة فحص مثبطات استهداف بين الخلايا

الهدف العام من هذا البروتوكول هو تقديم تقييم متعدد الأبعاد لكيفية تأثير المركبات على بقاء بكتيريا M.tuberculosis داخل البلاعم البشرية. تعتمد هذه الطريقة بشكل أساسي على مقايسة فعالية قائمة على لوسيفيريز. وعند دمجها مع اختبار السمية الخلوية ومقايسة التركيز المثبط الأدنى (MIC)، يمكن أن توفر معلومات مفيدة حول تعديل المركبات التي حققت استجابة (HIT compounds) في تطوير أدوية السل.

تكمن الميزة الرئيسية لطريقتنا في توفير الوقت والجهد؛ حيث تقوم باستبدال مقايسة وحدة تشكيل المستعمرات (CFU) بمقايسة تعتمد على لوسيفيريز (Luciferase). وبوجه عام، سيواجه الأشخاص المبتدئون في هذه التقنية صعوبة في تحقيق الاتساق عند استخدام الماصات اليدوية بدلاً من الأتمتة.

تُعد تقنية السحب الموحدة بالماصة أمراً بالغ الأهمية. يتم إنماء خلايا THP1 في وسط RPMI كامل. مع الحفاظ على كثافة خلوية تتراوح من 0.2 إلى مليون خلية لكل ملليلتر من الوسط بين مرات النقل.

استخدم مقياس الطيف الضوئي لقياس الكثافة الضوئية OD600 لمعلق بكتيري في مرحلة نمو نشط. ثم احسب الكثافة البكتيرية باستخدام معامل تحويل قدره 0.1 OD600 ما يعادل 3 × 10⁷ بكتيريا لكل ملليلتر. اسحب بالماصة كمية كافية من البكتيريا لتحقيق تعدد عدوى (MOI) بنسبة 10:1 وضعها في أنبوب طرد مركزي جديد.

ثم قم بترسيب البكتيريا عند 3,000 ×g لمدة 10 دقائق. ولتطويق البكتيريا (opsonization)، أضف 50 µL من المصل البشري إلى 450 µL من RPMI 1640 واستخدم هذا الخليط لإعادة تعليق الراسب البكتيري بكثافة 1 × 10⁸ بكتيريا لكل 500 µL من الوسط. اترك الخليط ليحضن عند 37 °C لمدة 30 دقيقة.

بعد ذلك، وباستخدام مقياس خلايا (hemocytometer) ومجهر مقلوب، قم بتحديد كثافة مستنبت خلايا THP1. ثم، في أنابيب طرد مركزي معقمة، قم بترسيب الخلايا عند 100 ×g في درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. اسحب السائل الطافي وأعد تعليق الخلايا في وسط RPMI كامل بتركيز مليون خلية لكل ملليلتر.

أضف PMA ليصل التركيز النهائي إلى 40 nanograms per milliliter. هذا هو خليط التمايز. ادمج M.tuberculosis الممتز بـ opsonin مع خليط تمايز THP1 بنسبة عدوى (MOI) تبلغ 10 إلى 1.

قم بتوزيع المزيج النهائي بحجم 100 µL لكل بئر في طبق أبيض مسطح القاع مكون من 96 بئراً. بعد ذلك، اترك عينات التمايز والعدوى لتتحضن عند 37 °C في حاضنة رطبة تحتوي على 5% carbon dioxide طوال الليل. وفي اليوم التالي، استخدم 100 µL من RPMI لغسل الآبار مرتين.

ثم أضف المركبات المخففة إلى التركيزات المطلوبة ووسط RPMI في وسط كامل. قم بحضن الأطباق لمدة ثلاثة أيام. عند استخدام الماصات متعددة القنوات، تذكر ممارسة ضغط بطيء وثابت على المكبس، والحرص دائماً على وضع رؤوس الماصة في نفس النقطة داخل كل بئر لتقليل اضطراب خلايا THP1.

بعد انتهاء الحضن، يتم سحب الوسط من الآبار وإضافة 50 µL من كاشف مقايسة اللوسيفيراز إلى كل بئر. ثم تُستخدم أختام صفائح لاصقة شفافة لإحكام غلق الصفائح. تُحضن الصفائح عند درجة حرارة 22 °C لمدة خمس دقائق، ثم يُستخدم مقياس لومينومتير للحصول على قراءة بمعدل ثانية واحدة لكل بئر.

لتمايز خلايا THP1، وبعد تحضير خليط التمايز كما تم توضيحه سابقاً في هذا الفيديو، وزع 100 µL من خليط التمايز في كل بئر من طبق خلايا شفاف يحتوي على 96 بئراً. قم بتحضين الخلايا عند 37 °C في حضانة رطبة تحتوي على 5% ثاني أكسيد الكربون طوال الليل. وفي اليوم التالي، قم بشفط الوسط من الآبار واستخدم RPMI 1640 لغسلها مرتين.

أضف 100 µL من المركبات المخففة في وسط RPMI غير الكامل إلى الآبار. ثم قم بتحضين الخلايا لمدة ثلاثة أيام. قم بإذابة 0.5 g من MTT في 100 mL من PBS لتحضير محلول مخزون بتركيز 5 mg/mL.

ثم قم بتعقيم المحلول عن طريق الترشيح. وقبل ساعتين ونصف من نهاية فترة الحضانة التي تستمر ثلاثة أيام، أضف 25 µL من محلول MTT إلى كل بئر من الخلايا وأكمل فترة الحضانة. قم بتحضير dimethylformamide أو DMF بتركيز 50% عن طريق خلط 250 mL من DMF مع 250 mL من الماء منزوع الأيونات.

قم بتحضير محلول استخلاص MTT كما يلي. ضع 100 grams من SDS في زجاجة سعة 500 milliliter وأضف 300 milliliters من 50%DMF. سَخّن المزيج بحرارة منخفضة للسماح بإذابة SDS.

أضف 10 milliliters من حمض الأسيتيك النقي و 12.5 milliliters من حمض الهيدروكلوريك بتركيز one molar. ثم، استخدم 50%DMF لملء الزجاجة حتى علامة 500 milliliter. في نهاية فترة المعالجة، أضف 100 microliters من محلول الاستخلاص المنظم إلى كل بئر.

قم بتحضين الخليط عند 37 درجة مئوية في حضانة رطبة تحتوي على 5% من ثاني أكسيد الكربون طوال الليل. في اليوم التالي، قم بقياس الامتصاصية عند 570 نانومتر. لإجراء مقايسة الريسازورين، قم بتنمية *M. tuberculosis* في وسط 7H9 ADST حتى الوصول إلى مرحلة النمو اللوغاريتمي المتوسط.

قم بتخفيف المزرعة باستخدام وسط 7H9 ADST حتى تصل الكثافة الضوئية OD600 إلى 0.01. استخدم وسط 7H9 ADST لتخفيف المركبات إلى ضعفي تركيزات الاختبار. ثم وزع 100 microliters من كل مركب مخفف في كل بئر من بئر صفيحة 96 بئر شفافة.

انقل 100 µL من المعلق البكتيري المخفف إلى كل بئر. حضن الأطباق عند 37 °C في حضانة رطبة لمدة خمسة أيام. أذب 10 mg من resazurin في 100 mL من الماء منزوع الأيونات.

وقم بتعقيم المحلول باستخدام الترشيح. أضف 30 µL من محلول resazurin إلى الآبار. ثم حضن الخلايا لمدة 48 ساعة.

يُستدل على النمو البكتيري من خلال تحول اللون من الأزرق إلى الوردي. قم بإجراء التحليل الكمي وفقًا لبروتوكول النص. يوضح هذا المخطط المبعثر بيانات التألق الخام المقاسة بوحدات التألق النسبية لمعالجة تركيزات مختلفة من rifampicin على خلايا M.tuberculosis وخلايا THP1.

يوضح هذا المخطط النسبة المئوية للانخفاض والوميض في الآبار المعالجة مقارنة بالآبار غير المعالجة. إن Rifampicin قادر على خفض 99.9% من وحدات الضوء النسبية، أو RLUs من M.tuberculosis داخل الخلايا بتركيز 0.1 micrograms per milliliter. وتتشابه هذه النتائج مع النتائج المنشورة سابقاً والتي تم تحديدها عن طريق CFU.

يوضح هذا الشكل السمية الخلوية الناتجة عن زيادة تركيزات G1-1H المستخدمة في مقايسة MTT. ومن الواضح أن تركيزي 10 و3 ميكرومولار يقعان دون حد IC 50. كما يبين هذا الشكل تأثيرات تركيزات مختلفة من المضاد الحيوي أبراميسين على تحويل الريسازورين بواسطة M.tuberculosis.

تراوحت قيمة MIC90 في المرق بين 2.5 وخمسة micrograms per milliliter. وهذه القيمة أعلى قليلاً من القيمة المنشورة سابقاً وهي 1.5 micrograms per milliliter، ولكنها لا تزال ضمن النطاق المقبول.

كما هو موضح هنا، يصبح التبخر عاملاً مؤثراً في جميع التجارب التي تتطلب فترات تحضين طويلة. لذا، يجب الحرص على الحفاظ على رطوبة المحضنات بشكل جيد لتجنب حدوث تضاربات في النتائج. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكنها توفير بيانات دقيقة عن داخل الخلايا في غضون أربعة أيام فقط.

عند محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر التعامل برفق مع خلايا THP1، والالتزام بالدقة والتناسق في عملية السحب والpipetting في حال التنفيذ دون استخدام الأنظمة الآلية. وبعد اتباع هذا الإجراء، يمكن استخدام طرق أخرى مثل الفحص عالي المحتوى (high content screening) لتحديد ما إذا كانت المركبات الناتجة (hit compounds) مثبطة للبكتيريا (bacteriostatic) أو قاتلة لها (bactericidal). وقد مهد هذا البروتوكول بعد تطويره الطريق للباحثين في مجال اكتشاف أدوية السل لتقييم فعالية المركبات بسرعة ضد MTB داخل البلاعم البشرية.

لا تنسَ أن العمل مع بكتيريا Mycobacterium tuberculosis ينطوي على خطورة. لذا، يجب اتخاذ الاحتياطات اللازمة واستخدام المعدات المناسبة عند التعامل مع هذا الكائن المجهري.