تحريض استجابة التهابية في الثقافات الابتدائية الكبدية من الفئران

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل خلايا كبدية وظيفية من الفئران بنجاح لدراسة تعبير وإفراز السيتوكينات الالتهابية مثل CRP وIL6 استجابةً لوسطاء استجابة المرحلة الحادة الكبدية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية حول وظيفة الخلايا الكبدية ومساهمة السيتوكينات الكبدية في بيئة التهابية مستمرة كما هو الحال في مرض الكلى المزمن. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنها توفر أداة قوية لتحليل بسيط وسريع وقابل للتكرار للأيضات الكبدية والالتهاب، بالإضافة إلى الاستجابة للأدوية.

للبدء، قم بتسخين وسط تروية الكبد ووسط هضم الكبد مسبقاً في حمام مائي عند 37 درجة مئوية. قم بإعداد مضخة التروية كما هو موضح هنا. ثم استخدم وسط تروية الكبد لملء نظام أنابيب المضخة بعناية.

حاول تجنب وجود أي فقاعات هوائية في النظام. قم بتجهيز المجهر التجسيمي لإجراء عملية التروية. بعد ذلك، وبعد تخدير فأر متبرع وفقاً للبروتوكول المكتوب، ضع الحيوان المخدر على وسادة ماصة.

استخدم شريطاً لاصقاً لتثبيت أطراف الفأر. بعد ذلك، قم بحلاقة وتطهير بطن الفأر. ثم استخدم مقصات جراحية ذات رؤوس مدببة غير حادة لإجراء عملية فتح بطن بطنية من العانة إلى الحدود القحفية للكبد.

قم بشق جدار البطن على كلا الجانبين في موضع خلف الحجاب الحاجز. اكشف الوريد الأجوف السفلي (IVC) عن طريق تحريك الأمعاء بعناية إلى الجانب الأيمن باستخدام مسحات قطنية معقمة. وباستخدام مقص جراحي دقيق ذو رؤوس حادة، قم بعمل شقوق جانبية عبر الحجاب الحاجز فوق الكبدي وافتح التجويف الصدري.

بعد ذلك، استخدم خيط جراحي حريري 5-0 لربط الوريد الأجوف السفلي الصدري. وباستخدام قسطرة وريدية محمية، قم بتركيب القسطرة في الوريد الأجوف السفلي تحت مستوى الكلية. صِل مضخة التروية وابدأ بتروية الكبد.

إذا تم تنفيذ الإجراء بشكل صحيح، يجب أن يبدأ الكبد فوراً في التبييض والانتفاخ. بعد ذلك، وباستخدام مقص جراحي دقيق، يتم قطع الوريد البابي، مما يسمح بالتصريف المناسب للدم ووسط التروية. بعد تروية الكبد بحوالي 30 milliliters من وسط تروية الكبد، يتم إيقاف مضخة التروية.

انتقل إلى وسط هضم الكبد وأعد تشغيل المضخة. بمجرد اكتمال التروية، قم بإزالة القنية. اكشف برفق عن المنطقة المركزية من الكبد وحدد النسيج الضام الذي يربط فصوص الكبد.

أمسك الألياف الرابطة المركزية وقم بتشريح جميع الأنسجة التي تثبت الكبد في مكانه بعناية. ثم أزل الكبد برفق. انقل العضو فوراً إلى أنبوب مخروطي من البولي بروبيلين سعة 50 milliliter يحتوي على 15 milliliters من وسط هضم الكبد.

أثناء العمل تحت غطاء استنبات الخلايا، انقل الكبد من أنبوب بولي بروبيلين مخروطي سعة 50 milliliter إلى طبق استنبات أنسجة معقم. وباستخدام ملاقط معقمة، قم بتمزيق فصوص الكبد الأربعة برفق. إذا تم الإجراء بشكل صحيح، يجب أن يصبح وسط الهضم عكراً نتيجة عزل الخلايا الكبدية من الكبد.

باستخدام رأس ماصة معقم سعة 25 ملليلتر، قم بترشيح وسط الهضم العكر عبر مصفاة خلايا نايلون بمسام 70 ميكرومتر في أنبوب مخروطي جديد من البولي بروبيلين سعة 50 ملليلتر لإزالة جزيئات الأنسجة غير المهضومة وبقايا الخلايا. قم بطرد الرواسب للراشح المجمع بسرعة 50 ×g عند درجة حرارة 4 °C لمدة دقيقتين، ثم اسحب السائل الطافي الذي يحتوي على بقايا الخلايا الزائدة واستخدم 25 ملليلتر من وسط William's Medium E بتركيز 1X بارد لإعادة تعليق الخلايا برفق. بعد تكرار عملية ترشيح وغسل الخلايا الكبدية ثلاث مرات، اسحب السائل الطافي لإزالة بقايا الخلايا الزائدة.

أعد تعليق الخلايا في 25 ملليلتر من وسط William's Medium E تركيز 1X الدافئ الذي يحتوي على مكملات إذابة وزراعة الخلايا الكبدية الأولية، ثم قم بترشيح المعلق عبر مصفاة خلايا نايلونية جديدة بقطر مسام 70 ميكرومتر في أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلتر. وبمجرد عد الخلايا، ازرعها في 2 ملليلتر من وسط William's Medium E الذي يحتوي على مكملات إذابة وزراعة الخلايا الكبدية الأولية في مجموعة زراعة خلوية ذات ستة آبار مغطاة بالكولاجين. وبعد تغيير الوسط مرتين لتجويع الخلايا في نهاية المطاف، عامل الخلايا باستخدام PBS كمادة حاملة، أو 25 نانوجرام لكل ملليلتر من FGF23، أو 100 ميكروجرام لكل ملليلتر من LPS، أو 50 نانوجرام لكل ملليلتر من IL6 في وسط خالٍ من المصل.

يُحضن المزارع لمدة 24 ساعة. بعد تحضير الـ RNA باستخدام طقم أعمدة الطرد المركزي (spin column kit) وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة، يُضاف 200 nanograms من الـ RNA المعزول إلى أنبوب PCR. ثم يُضاف 14 microliters من الماء الخالي من الإندونيوكلياز وأربعة microliters من إنزيم النسخ العكسي (reverse transcriptase) إلى الأنبوب.

ضع أنبوب الـ PCR في جهاز التدوير الحراري وشغل برنامج النسخ العكسي التالي لتوليد الـ cDNA. ولإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR)، اخلط مكونات المزيج الرئيسي لـ QPCR التالية في أنبوب على الثلج. ثم قم برج المزيج الرئيسي باستخدام جهاز الفورتيكس.

ثم قم بتوزيع 9 µL من المحلول في كل بئر من ألواح 96 بئرًا. أضف بعناية 1 µL من cDNA إلى كل بئر، مع تجهيز ثلاثة آبار لكل عينة. وأخيرًا، قم بتشغيل العينات في جهاز real-time PCR وتحليل البيانات وفقًا للبروتوكول المكتوب.

تظهر هنا صورة مجهرية ضوئية ممثلة للخلايا الأولية المعزولة والمستنبتة. يوضح التحليل الكيميائي النسيجي المناعي أن الخلايا الكبدية المعزولة تعبر بدرجة عالية عن الألبومين وكذلك مستقبل عامل نمو الخلايا الليفية 4. في هذه التجربة، عولجت الخلايا الكبدية الأولية المعزولة بـ FGF23، أو LPS، أو IL6 لمدة 24 ساعة، وتم تحليل مستويات mRNA لـ CRP و IL6 عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي qPCR.

أدت كل من LPS وIL6 وFGF23 إلى زيادة تعبير CRP وIL6 بشكل ملحوظ. وكما هو موضح هنا، تم تحليل المواد الطافية للمزارع الخلوية من الخلايا الكبدية الأولية المعزولة بواسطة تقنية ELISA لتحديد مستويات CRP. وكما أظهر تحليل QPCR، أدت المعالجة بـ LPS وIL6 وFGF23 إلى زيادة مستويات CRP بشكل ملحوظ في المواد الطافية للخلايا مقارنة بالخلايا المعالجة بـ PBS.

بمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون ساعات قليلة فقط إذا تم تطبيقها بشكل صحيح. وأثناء محاولة إجراء هذا الإجراء، من المهم تذكر الحفاظ على بيئة معقمة. ونظراً للعمل مع المزارع الأولية، فإن تقليل مخاطر التلوث المحتمل هو الأمر الأكثر أهمية لتحقيق أفضل النتائج.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل الخلايا الكبدية الفأرية بنجاح لدراسة مختلف الوظائف الكبدية مثل تعبير وإفراز السيتوكينات الكبدية.