تحليل الخلايا السطحية التصاق إعادة عرض في الاستجابة للتوتر الميكانيكية باستخدام الخرز المغناطيسي
مارس 8, 2017
التصاقات سطح الخلية هي المركزية في mechanotransduction، كما نقل التوتر الميكانيكية والشروع في مسارات الإشارات المشاركة في توازن الأنسجة والتنمية. هنا، نقدم بروتوكول لتشريح المسارات البيوكيميائية التي يتم تفعيلها في فعل للتوتر، وذلك باستخدام ميكروبيدات المغناطيسي المغلفة يجند وتطبيق قوة لمستقبلات الالتصاق.
الهدف العام من هذه التجربة هو استكشاف المسارات الكيميائية الحيوية التي يتم تنشيطها استجابة للتوتر باستخدام الميكروبيدات المغناطيسية المطلية بالترابط والتطبيق القسري على مستقبلات الالتصاق. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة في مجال المعاملات الميكانيكية مثل كيفية توجيهها للتوتر الميكانيكي من القياسات الهلوية السريعة من التمايز أو كيف يدفع امتثال الأنسجة تحولها. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن تحفيز العديد من الخلايا للتحليل الكيميائي باستخدام الخرز لتطبيق التوتر على مجموعة فرعية محددة من مستقبلات الالتصاق.
للبدء ، قم بإعادة تعليق الخرز المغناطيسي الفائق في القارورة الأصلية عن طريق الدوامة لمدة 30 ثانية على الأقل. Aliquot 40 ميكرولترا من الخرزات المغناطيسية الفائقة المعلقة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مليلتر يحتوي على مليلتر واحد 0.1 مولار من فوسفات الصوديوم الرقم الهيدروجيني 7.4. بعد ذلك ، ضع الأنبوب على حامل فصل مغناطيسي لفصل الخرز المغناطيسي عن المحلول.
تخلص من المادة الطافية وقم بإزالة الأنبوب من حامل الفصل المغناطيسي. أعد تعليق الخرزات في مليلتر واحد 0.1 مولار فوسفات الصوديوم الرقم الهيدروجيني 7.4. بعد غسل الخرزات مرتين ، قم بتعليق الخرز في مليلتر واحد من نفس المخزن المؤقت.
بعد ذلك ، امزج 100 ميكروغرام من الفيبرونيكتين البقري أو أي رابط مستقبلات التصاق الخلية الأخرى بالخرز والدوامة. كرر هذه الخطوة عن طريق استبدال الترابط ب BSA أو poly-D-lysine أو apotransferrin للضوابط السلبية. احتضان الخرزات بمحلول يحتوي على الترابط لمدة 12 إلى 24 ساعة عند 37 درجة مئوية على الدوار.
إذا ظهرت مجاميع الخرزة بعد حدوث التفاعل ، فقم بالصوتنة لمدة لا تزيد عن 10 إلى 20 ثانية. بعد ذلك ، قم بعزل الخرزات باستخدام حامل فصل مغناطيسي واستنشاق المحلول المتبقي. ثم أضف مليلتر واحد من محلول PBS مكمل بنسبة 0.2٪ زلال مصل الأبقار.
احتضن لمدة ساعة على دوار عند 37 درجة مئوية. باستخدام مغناطيس ، اغسل الخرزات بمليلتر واحد من محلول PBS المكمل ب 0.2٪ زلال مصل البقر مرتين. قبل تعليقها في مليلتر واحد من نفس المخزن المؤقت.
قم بتقطيع الخرز إذا ظهرت الركام لمدة لا تزيد عن 20 إلى 30 ثانية. انتقل إلى فحوصات الخلية ، أو قم بتخزين الخرزات عند أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد. زراعة الخلايا الملتصقة على طبق زراعة الأنسجة 60 مليلتر في وسط نمو مناسب حتى تصل إلى التقاء 80٪.
بعد تكوير الخرز المطلي بالترابط ، قم بتعليق الحبيبات في مليلتر واحد من محلول PBS المكمل ب 0.2٪ زلال مصل البقري. أضف 100 ميكرولتر من محلول الخرزة المطلي بالترابط إلى خمسة ملليلتر من وسط الثقافة الدافئة والدوامة. بعد ذلك ، استنشق الوسط في طبق ثقافة سعة 60 مليلتر وأضف خمسة ملليلتر من وسط النمو الدافئ المكمل بالخرز.
احتضان المعلق لمدة 20 دقيقة في ظل ظروف زراعة الخلايا للسماح للحبات بالترسيب والالتصاق بالخلايا. من الضروري ألا تتجاوز 20 دقيقة ، حيث يمكن استيعاب الخرزات عن طريق البلعمة. بعد ذلك ، راقب الخرزات تحت مجهر ضوئي باستخدام هدف 10X أو 20X.
تحقق من عدم التصاق الخرزة عن طريق هز الطبق قليلا للتمييز بين الخرزات المرفقة والعائمة. ضع مغناطيس نيوديميوم دائري مقاس 38 ملم على الوجه العلوي لغطاء طبق ثقافة عادي مقاس 60 ملم واحتفظ به في مكانه باستخدام مغناطيسي نيوديميوم أصغر حجما مقاس 13 ملم موضوعين على الوجه السفلي للغطاء. احتضان الخلايا المعرضة للتوتر للنقاط الزمنية المرغوبة وظروف زراعة الخلايا.
استبدل غطاء الطبق العادي بغطاء بالمغناطيس. نظرا لأن المغناطيس قوي جدا ، فقم بمعالجته بعناية. بعد العلاج ، ضع الطبق على الثلج واستنشق الوسط بالكامل بعناية من الطبق.
أضف 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتحلل الخلايا واحتضنه لمدة 10 دقائق على الثلج. بعد ذلك ، اجمع المحللة باستخدام مكشطة خلية وقم بنقله إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر مبرد مسبقا. قم بتكسير الخرزات المغناطيسية باستخدام حامل الفصل المغناطيسي وانقل محللة الخلية الكلية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد مبرد مسبقا سعة 1.5 مل.
قم بإزالة 15 ميكرولتر من إجمالي محللة الخلية التي تم الحصول عليها بعد فصل الخرزة لتحليل اللطخة الغربية. اغسل الخرزات ثلاث مرات بمليلتر واحد من محلول التحلل المثلج. ثم أضف 50 ميكرولتر من عينة المخزن المؤقت إلى حبيبات الخرزة.
بعد خلط المعلق عن طريق الدوامة ، قم بغليه على حرارة 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق باستخدام سخان كتلة جاف. يحتوي هذا الجزء على مجمعات الالتصاق المعزولة. انتقل إلى التحليل الكيميائي الحيوي أو قم بتخزين الكسر عند 20 درجة مئوية تحت الصفر.
يظهر هذا الشكل لتوضيح تنقية مجمعات الالتصاق. يستخدم النشاف المناعي GAPDH كعنصر تحكم في التحميل لمحللة الخلية الكلية وللتحقق من نقاء مجمعات الالتصاق. تم استخدام التعرض الطويل للتحقق من صحة عدم وجود إشارة سيتوبلازمية في الجزء المركب المعقد للالتصاق المنقى.
تم استخدام حبات الفيبرونيكتين المطلية للتحقيق في عمليات النقل الميكانيكي التي تحدث بمرور الوقت في مجمعات الالتصاق استجابة للتوتر. بعد الفصل المغناطيسي للجزء المركب المعقد ، تم تحليل المحللة والكسر المركب المركب بواسطة اللطخة الغربية. تم التحكم في التحميل والمرشحين المعروفين بتجنيدهم أو فسفرتهم في مجمعات الالتصاق استجابة للتوتر الميكانيكي مناعيين.
في حين أن التوتر لم يؤثر على تجنيد باكسيلين في مجمعات الالتصاق ، فقد تم تعزيز فسفرته على التيروزين 31 استجابة للتوتر الميكانيكي في كل من محللة الخلية الكلية وفي الجزء المركب المركب. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تطبيق قوى الشد على بروتينات سطح الالتصاق باستخدام الخرز المغناطيسي. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في غضون ساعتين إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.
أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر توخي الحذر مع المغناطيس القوي. بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء دراسات كيميائية حيوية مثل البقع الغربية أو مقايسة بلمرة الأكتين أو الفحص الأنزيمي للإجابة على أسئلة إضافية مثل ما إذا كان نشاط كيناز ينظمه التوتر. قد تساعد هذه التقنية الباحثين في مجال بيولوجيا الخلية على استكشاف مسارات الإشارات المغناطيسية الحساسة في الخلايا.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة بروتوكولاً لدراسة المسارات البيوكيميائية التي يتم تنشيطها بواسطة التوتر الميكانيكي عند التصاقات سطح الخلية. باستخدام حبات مغناطيسية مغلفة بالرابط، يمكن للباحثين تطبيق القوة على مستقبلات الالتصاق، مما يسهل دراسة التحويل الميكانيكي في توازن الأنسجة وتطورها.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- التحويل الميكانيكي
- التصاق الخلية
- المسارات البيوكيميائية للإشارات
الخلفية
- تلعب التصاقات سطح الخلية دورًا حاسمًا في التحويل الميكانيكي.
- يتأثّر تطور الأنسجة وتوازنها بالتوتر الميكانيكي.
- يمكن أن يوفر فهم هذه المسارات رؤى حول استجابات الخلايا للمحفزات الميكانيكية.
- توفر الحبات المغناطيسية المغلفة بالرابط طريقة لتطبيق توتر متحكم فيه على مستقبلات الالتصاق المحددة.
هدف الدراسة
- لدراسة كيفية تنشيط التوتر الميكانيكي للمسارات البيوكيمائية.
- لدراسة دور التوتر الميكانيكي في تمايز الخلية.
- لفهم كيف يؤثر ملاءمة الأنسجة على التحولات الخلوية.
الطرق المستخدمة
- إعادة تعليق حبات التيوسيل المنشطة فائقة المغناطيسية.
- توزيع الحبات في محلول فوسفات الصوديوم.
- استخدام حامل الفصل المغناطيسي لفصل الحبات.
- تطبيق القوة على مستقبلات الالتصاق للتحليل.
النتائج الرئيسية
- تسمح الطريقة بتحفيز خلايا متعددة للتحليل البيوكيميائي.
- يمكن استهداف مجموعات محددة من مستقبلات الالتصاق.
- يمكن الحصول على رؤى حول عملية التحويل الميكانيكي.
- تطبيقات محتملة في فهم ميكانيكا الأنسجة والسلوك الخلوي.
الاستنتاجات
- يوفر هذا البروتوكول أداة قيّمة لدراسة التحويل الميكانيكي.
- يعزز فهمنا لكيفية تأثير القوى الميكانيكية على العمليات الخلوية.
- يمكن للبحوث المستقبلية أن تبني على هذه النتائج لاستكشاف استراتيجيات علاجية جديدة.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Mechanical tension at cell surface adhesions drives signaling pathways that influence phenotypic outcomes and tissue development. Understanding these mechanotransduction mechanisms enables target validation in diseases where adhesion remodeling is implicated, such as fibrosis and cancer metastasis. This method supports preclinical de-risking by linking mechanical stimuli to biochemical readouts, improving predictive confidence in early discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates force-dependent signaling pathways at integrin-based adhesions to clarify mechanistic hypotheses.
- Operational Value: Enables isolation of adhesion complexes for biochemical analysis of phosphorylation events.
- Predictive Value: Supports target confidence by identifying tension-responsive nodes like phosphorylated Paxillin.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares ligand-coated magnetic beads to apply defined tensile forces to specific receptor subsets.
- Operational Value: Standardizes force application across samples for reproducible adhesion remodeling readouts.
- Assay Readiness: Generates purified adhesion complexes compatible with western blotting and enzymatic assays.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects mechanical inputs to biochemical outputs in disease-relevant adhesion signaling.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether kinase activity or cytoskeletal dynamics are regulated by tension.
- Preclinical Model Support: Provides a disease-relevant system to study how tissue compliance influences cellular transformation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification by providing quantitative, force-dependent biochemical data.
- Discovery Biology: Tests how mechanical tension directs cellular differentiation or transformation via adhesion receptor stimulation.
- Screening: Delivers reproducible, ligand-specific force application to prepare cells for downstream compound screening.
- Analytics: Enables western blot analysis of adhesion complex fractions to measure tyrosine phosphorylation and protein recruitment.
- Translational Research: Supports biomarker alignment by linking tension-induced phosphorylation to phenotypic outputs.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for applying controlled tension across multiple adhesion receptors and cell types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in mechanotransduction by isolating force-sensitive adhesion complexes.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized bead preparation and magnetic separation steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by validating targets under physiologically relevant mechanical conditions.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on tension-dependent signaling fidelity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, magnetic bead handling, and western blot techniques.
- Needs magnetic separation stands, neodymium magnets, and ligand coating capabilities.
- Demands standardization of bead ligand density and incubation times across experiments.
- Must account for phagocytosis risk by limiting bead-cell incubation to 20 minutes.
- Limited to surface adhesion receptors; cannot probe intracellular mechanosensors directly.
