إعادة تشكيل جسيم نووي مع الهستونات الأخت المسمى النظائر-تفاضلي

الهدف العام من هذا البروتوكول الكيميائي الحيوي هو إنتاج نوكليوسومات تحتوي على هيستونات شقيقة مُعلمة بنظائر مختلفة، وذلك لاستخدامها في تحديد مواقع تفاعلات تعديل ما بعد الترجمة بشكل متزامن على كلتا الهيستونات الشقيقتين. الهدف العام من هذا البروتوكول الكيميائي الحيوي هو إنتاج نوكليوسومات تحتوي على هيستونات شقيقة مُعلمة بنظائر مختلفة لاستخدامها في تحديد مواقع تعديلات ما بعد الترجمة بشكل متزامن على كلتا الهيستونات الشقيقتين.

تعالج هذه الطريقة، بالاقتران مع تقنيات عالية الدقة لرسم خرائط التعديلات ما بعد الترجمة كما هو الحال في مطيافية الكتلة، أسئلة رئيسية في بيولوجيا الكروماتين، مثل: ما هي الآليات التي تساهم في تكوين نيوكليوسومات معدلة بشكل متماثل؟ وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في إمكانية تطبيقها بسهولة في المختبرات الكيميائية الحيوية، لأنها تدمج بروتوكولات إعادة تشكيل النيوكليوسوم القياسية مع منهجيات تنقية البروتين الشائعة. سيتم استخدام مجموعتين من هيستون H3 لإعادة تشكيل الثماني (octamer).

بروتين H3 المسمى بالنيتروجين 15 والذي يحتوي على وسم متعدد الهيستيدين (polyhistidine-tag) عند الطرف الأميني، وبروتين H3 المسمى بالكربون 13 والذي يحتوي على وسم ألفينيتي ستربتأفيدين (streptavidin affinity tag) عند الطرف الأميني. ابدأ هذا الإجراء بإذابة حصص الهيستون المجففة بالتجميد، بما في ذلك النوعين من الهيستون H3، في محلول التفكيك المنظم (unfolding buffer). أضف 1 mL من محلول التفكيك المنظم إلى كل أنبوب يحتوي على حوالي 5 mg من الهيستونات، واخلط المزيج باستخدام الماصة، مع تجنب استخدام جهاز الرج الميكانيكي (vortex).

تُحفظ الأنابيب على الثلج لمدة 30 دقيقة للسماح بفك الطي الكامل. بعد ذلك، يتم قياس الامتصاصية عند 280 نانومتر لتحديد التركيز الدقيق لكل هيستون. اخلط الهيستونات الأساسية بنسب مولارية متساوية، مع مراعاة تضمين 50% من كل من مجموعتي الهيستون H3.

استخدم محلول التفكيك (unfolding buffer) لضبط التركيز النهائي للبروتين ليصل إلى حوالي 1 mg/mL تقريباً. انقل الخليط إلى غشاء دياليز بحد قطع يبلغ 6 kDa. ثم قم بإجراء عملية الدياليز مقابل 1 إلى 2 لتر من محلول إعادة الطي (refolding buffer) المبرد عند درجة حرارة 4 °C.

في اليوم التالي، اجمع المادة التي خضعت للديلزة وأزل أي رواسب عن طريق الطرد المركزي في جهاز طرد مركزي دقيق لمدة خمس دقائق عند درجة حرارة 4 °C وبأقصى سرعة. بعد تحديد تركيز الثماني (octamer)، استخدم وحدة ترشيح مركزية بحد قطع 10 kilodalton لتركيز الثماني إلى حجم نهائي يبلغ حوالي 2 milliliters. يجب الحصول على تركيز للثماني يتراوح بين 50 إلى 100 micromolar.

استعد لعملية الترشيح الهلامي عن طريق توصيل عمود الترشيح الهلامي بنظام FPLC. قم بموازنة العمود باستخدام حجمين من سعة العمود (CV) من محلول التثني المرشح بمرشح 0.22 micrometer ومنزوع الغازات. احقن المادة المركزة بمعدل تدفق قدره 1 milliliter في الدقيقة، ثم اجمع كسوراً تتراوح أحجامها بين 1 إلى 1.5 milliliter.

لبدء هذا الإجراء، يتم تجميع الكسور ذات الصلة التي تحتوي على ثمانيات القسيمات (octamers) النقية وتحديد التركيز كما تم وصفه سابقاً. قم بتوصيل عمود حمض النيتريلوتري أسيتيك والنيكل (nickel nitrilotriacetic acid) أو عمود nickel NTA بحجم 1 mL بنظام FPLC. ثم يتم موازنته باستخدام 10 CV من محلول منظم لإعادة الطي (refolding buffer) المفلتر بمرشح 0.22 µm والمزال منه الغازات، وذلك بمعدل تدفق قدره 1 mL/min.

مرر الثماني المُنقى عبر عمود nickel NTA بمعدل تدفق يبلغ 1 mL/min. اجمع السائل المار. قم بإجراء عملية الشطف (elution) باستخدام 10 CV من منظم إعادة الطي (refolding buffer) الذي يحتوي على 250 mM من imidazole بمعدل تدفق يبلغ 1 mL/min.

اجمع ناتج شطف النيكل NTA. ويفضل إجراء عملية التنقية القائمة على الستريبتفيدين في غرفة باردة. قم بموازنة عمود ألفة سعة 1 مل من ستريبتفيدين تجاري باستخدام 10 CV من محلول إعادة الطي المنظم الذي يحتوي على 250 millimolar من الإيميدازول، وذلك باستخدام إعداد تدفق الجاذبية بنظام الدفعات.

مرر ناتج شطف عمود النيكل NTA عبر عمود ألفينية الستريبتاديفين. اجمع السائل المار. قم بإجراء الشطف باستخدام 10 CV من محلول إعادة الطي المنظم الذي يحتوي على 2.5 millimolar من الديسثيوبايوتين.

قم بجمع ناتج الشطف. بعد قياس تركيز الثماني (octamer) في ناتج الشطف، أضف بروتياز TEV بكمية أقل بـ 10 مرات، واترك التفاعل يستمر طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C. في اليوم التالي، انقل الخليط إلى غشاء دياليز بحد قطع 50 kilodalton وقم بإجراء الديلزة مقابل محلول إعادة الطي (refolding buffer) طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C.

قم بتركيز octamer غير المتماثل المُنقى باستخدام وحدة ترشيح طاردة مركزية بحد قطع 10 kilodalton وصولاً إلى حجم يتراوح بين 1 إلى 2 milliliters. تركيز octamer المتوقع هو 20 إلى 50 micromolar. تتطلب عملية إعادة تشكيل النوكليوسوم DNA يحتوي على تسلسل تحديد موقع النوكليوسوم.

اضبط تركيز ملح الـ DNA إلى 2 molar من كلوريد الصوديوم باستخدام محلول مخزون من كلوريد الصوديوم بتركيز 5 molar. اخلط الـ DNA مع الثماني (octamer) ومحلول إعادة الطي المنظم (refolding buffer) باستخدام النسبة المثلى من الثماني إلى الـ DNA والتي تم تحديدها من خلال اختبار صغير النطاق. أضف الثماني في النهاية لمنع أي احتمالية لخلط الثماني والـ DNA عند تركيز ملحي أقل من 2 molar.

انقل الخليط إلى غشاء دياليز بحد قطع قدره 6 kilodalton وقم بإجراء الدياليز مقابل لتر واحد من محلول إعادة الطي المنظم (refolding buffer) طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C. وفي اليوم التالي، قم بخفض تركيز الملح في محلول الدياليز المنظم تدريجياً، مع إبقاء العينة في كل محلول منظم من كلوريد الصوديوم لمدة ثلاث ساعات على الأقل.

بعد ذلك، انقل غشاء الديلزة إلى دورق يحتوي على لتر واحد من محلول منظم للمقايسة، واستمر في عملية الديلزة طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C. وفي اليوم التالي، اجمع العينة التي خضعت للديلزة. ثم تخلص من أي رواسب متكونة عن طريق الطرد المركزي في جهاز طرد مركزي دقيق لمدة خمس دقائق عند درجة حرارة 4 °C وبأقصى سرعة.

قم بتركيز العينة باستخدام وحدة ترشيح طرد مركزي بحد قطع 30 kilodalton حتى يصل الحجم النهائي إلى حوالي 300 microliters. قم بقياس تركيز الـ DNA عند 260 nanometers. يجب أن يكون التركيز النهائي في نطاق يتراوح بين 10 إلى 20 micromolar.

يُحفظ sample عند درجة حرارة 4 °C لمدة تصل إلى عدة أسابيع. يظهر ملف شطف الترشيح الهلامي (gel filtration elution profile) لخليط الهيستون المعاد طيه شطف octamers الهيستون عند حوالي 70 mL. ويظهر هلام SDS page التكافؤ الكمي (stoichiometry) الصحيح للهيستون.

يخضع تجمع الثمانيات المُعاد تشكيله، والذي يحتوي على الأنواع الثلاثة من الثمانيات، لمخطط تنقية بالتقارب الترادفي. ويتم التحقق من عزل الأنواع غير المتماثلة من خلال وجود وسم التقارب. بعد ذلك، تُزال وسوم التقارب باستخدام بروتياز TEV.

أظهرت عملية إعادة تكوين النيوكليوسوم على نطاق صغير باستخدام نسب مولية مختلفة من DNA إلى الثماني (octamer) أن النسبة المثلى كانت واحد إلى واحد. وقد أُجريت عملية إعادة تكوين النيوكليوسوم على نطاق واسع باستخدام النسبة المولية المحسنة من DNA إلى الثماني، ولوحظت القياسات المتكافئة الصحيحة للهيستونات الأساسية الأربعة. وأكد مطياف الرنين المغناطيسي النووي (NMR spectroscopy) للنيوكليوسومات الموسومة بنظائر مختلفة وجود هيستونات H3 شقيقة موسومة بالنيتروجين 15 والكربون 13.

في هذا المثال التطبيقي، تم تفاعل النوكليوسومات التي تم وسمها بنظائر مختلفة وفسفرتها بشكل غير متماثل عند الحلقة C 10 للهيستون H3 مع إنزيم GCN5 acetyltransferase. وتم تتبع عملية أسيتلة اللايسين 14 للهيستون H3 في كلتا نسختي H3 في الوقت الفعلي باستخدام مطيافية NMR. وقد كشف التحليل أن فسفرة الحلقة C 10 للهيستون H3 تحفز أسيتلة اللايسين 14 للهيستون H3 بواسطة GCN5 بآلية cis مقارنة بآلية trans.

بمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون خمسة أيام إذا تم تطبيقها بشكل صحيح. بعد مشاهدة هذا الفيديو، سيكون لديك فهم جيد لكيفية إعادة تكوين النيوكليوسومات التي تحتوي على هيستونات شقيقة بخصائص مختلفة.