عمليات الاستخراج الملح متسلسلة لتحليل الكروماتين الأكبر ربط خصائص لتعديل مجمعات الكروماتين
أكتوبر 2, 2017
استخراج الملح متسلسلة من البروتينات الكروماتين ملزمة أداة مفيدة لتحديد خصائص ربط مجمعات كبيرة من البروتين. ويمكن استخدام هذا الأسلوب لتقييم دور مفارز الفردية أو المجالات في تقارب شامل بروتين معقدة لمعظم الكروماتين.
الهدف العام من إجراء استخراج الملح المتسلسل هو توصيف ملامح ربط البروتين بالكروماتين السائب وتقييم كيفية تغيير الارتباط عند التلاعب بالبروتين أو بيئته. تقيس هذه الطريقة التقارب النسبي للمنظمات اللاجينية مع الكروماتين ، ويمكن استخدامها لتقييم كيفية تغير هذه التفاعلات عند التلاعب الجيني والكيميائي والبيئي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها طريقة سريعة وغير مكلفة لتقييم ملامح الربط للبروتينات المرتبطة بالكروماتين.
غالبا ما يعاني الأفراد الجدد في مجال الكروماتين من الترسيب المناعي للكروماتين ، أو ChIP. استخراج الملح المتسلسل هو تقنية قديمة يمكن حتى للعلماء عديمي الخبرة استخدامها للإجابة على العديد من الأسئلة نفسها. لبدء الإجراء ، قم بحصاد 8،000،000 خلية من كل خط خلية محل اهتمام.
اغسل كل عينة خلية بخمسة ملليلتر من PBS المثلج مرتين. أعد تعليق كل عينة ومليلتر واحد من المخزن المؤقت منخفض التوتر باستخدام مثبطات الإنزيم البروتيني. نقل معلقات الخلية إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 ملليلتر.
قم بتدوير نظام التعليق ، من أعلى إلى أسفل ، لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية ، ثم قم بالطرد المركزي للتعليق لمدة خمس دقائق عند نفس درجة الحرارة عند 6 ، 000 جيجا. تخلص من المادة الطافية. جهز ماصة صغيرة برأس مليلتر واحد.
أضف إلى الحبيبات 200 ميكرولتر من محلول الريبا المعدل الخالي من الملح مع مثبطات البروتياز. اضغط على طرف الماصة على الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي الدقيق لسحب الحبيبات إلى الحافة. ماصة الحبيبات لأعلى ولأسفل 15 مرة.
يجب أن تصبح العينة سميكة ولزجة مع تفكك الحبيبات. قم بتجانس كل عينة بهذه الطريقة واحتضان العينات على الجليد لمدة ثلاث دقائق. ثم قم بالطرد المركزي للعينات عند 6500 جيجا في أربع درجات مئوية لمدة ثلاث دقائق.
انقل المواد الطافية لتنظيف أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 ملليلتر. أضف إلى كل بيليه 200 مل من محلول ripa المعدل مع 100 مللي مولار كلوريد الصوديوم ومثبطات البروتياز. ماصة الحبيبات لأعلى ولأسفل 15 مرة.
إذا كان من الصعب في البداية سحب الحبيبات في طرف الماصة ، فاضغط على الطرف الموجود أسفل الأنبوب. كرر هذه العملية لكل عينة واحتضان العينات على الجليد لمدة ثلاث دقائق. الطرد المركزي للعينات عند 6500 جيجا في أربع درجات مئوية لمدة ثلاث دقائق.
انقل المواد الطافية إلى أنابيب جديدة من أجهزة الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 ملليلتر. استمر في استخراج العينات في محاليل المقاومة المعدلة مع زيادة تركيزات كلوريد الصوديوم. عندما لا تبقى الحبيبات في قاع الأنبوب, ضع الحبيبات في غطاء أنبوب الطرد المركزي قبل صب المادة الطافية.
بعد استخراج الملح التسلسلي ، لكل عينة ، أضف 70 مل من صبغة تحميل البروتين أربع مرات إلى كل جزء من الكسور الطافية الخمسة. قم بتحميل 30 ميكرولترا من كل جزء على هلام أكريلاميد SDS. قم بإجراء لطخة غربية قياسية عن طريق نقل البروتينات إلى غشاء وتلطيخها بالأجسام المضادة الأولية المناسبة.
احتضان اللطخة في الأجسام المضادة الثانوية المسمى بصبغة الأشعة تحت الحمراء وقم بتصوير اللطخة. استخدم برنامج تحليل الصور لحساب شدة النطاق لكل تركيز ملح. ارسم شدة الشريط مقابل تركيز الملح لتحديد نمط شطف البروتين المعني.
أظهر استخراج الملح المتسلسل للبروتينات ARID1a و Polybromo 1 تخفيفا ثابتا بتركيزات ملح تبلغ 200 و 300 مللي مولار على التوالي. أظهر استخراج الملح غير المتسلسل لنفس البروتينات نتائج أقل اتساقا. يجب تحسين وقت الحضانة لكل بروتين يتم فحصه.
وبالتالي ، تم استخدام SSE لفحص ملامح الشطف بعد أطوال حضانة متفاوتة. أظهر منشط النسخ ، Polybromo 1 ، ملفات تعريف شطف مماثلة عند تحضينها لمدة ثلاث دقائق و 10 دقائق. احتاج مثبط النسخ ، Polycomb Repressive Complex 1 ، المشار إليه بواسطة BMI1 ، إلى أكثر من ثلاث دقائق ليتم إطلاقه من الكروماتين.
تم التحقيق في تفاعلات البروتين والبروتين من خلال فحص التغيير في ملامح الشطف. في وجود مثبط ، ألمح البرومودومين الذي يحتوي على البروتين الرابع إلى تركيزات ملح أقل من عدم وجود المثبط. لوحظت اختلافات في رقطقة هيستون عندما عولجت الخلايا بمثبط هيستون ديستيلاز ، مما أدى إلى تغيير مشهد الكروماتين.
انعكست التغييرات في ارتباط البروتين عندما تعرضت الخلايا للإجهاد الجيني أيضا في ملامح الشطف. هنا ، تشير الزيادة في تركيز الملح اللازم للشطف إلى أن Polybromo 1 يرتبط بإحكام بالكروماتين بعد تلف الحمض النووي باستخدام دوكسوروبيسين. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في غضون ساعتين إلى ثلاث ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.
أثناء محاولة هذا الإجراء، تذكر أن تكون متسقا قدر الإمكان مع علاجك لكل عينة. يمكن استخدام هذا الإجراء في الخطوات الأولية للدراسة لتوضيح آلية وتنظيم بروتين مرتبط بالكروماتين. هذا يوفر الوقت والمال في الدراسات غير الضرورية على مستوى الجينوم.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
صُمم إجراء استخلاص الملح المتسلسل لتوصيف ملفات ارتباط البروتين بالكروماتين الكلي، وتقييم كيفية تغير هذه الارتباطات نتيجةً لمختلف عمليات المعالجة. وتُعد هذه الطريقة مفيدة بشكل خاص لتقييم ألفة المنظمات فوق الجينية للكروماتين.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال العلوم
- بيولوجيا الكروماتين
- التفاعلات البروتينية
- علم فوق الجينات
خلفية علمية
- يعتبر الاستخلاص المتسلسل بالأملاح تقنية لدراسة البروتينات المرتبطة بالكروماتين.
- وتوفر هذه التقنية بديلاً سريعاً ومنخفض التكلفة لعملية الترسيب المناعي للكروماتين (ChIP).
- تتميز هذه الطريقة بأنها متاحة حتى للعلماء المبتدئين.
- وتسمح هذه الطريقة بتقييم كيفية تغير التفاعلات البروتينية بتأثير العوامل الوراثية والكيميائية والبيئية.
الغرض من الدراسة
- توصيف أنماط ارتباط البروتينات المرتبطة بالكروماتين.
- تقييم تأثيرات المعالجات المختلفة على ارتباط البروتين.
- توفير طريقة مباشرة للباحثين في مجال الكروماتين.
الطرق المستخدمة
- حصاد 8,000,000 خلية من كل خط خلوي مستهدف.
- استخلاص ملحي متسلسل لعزل البروتينات المرتبطة بالكروماتين.
- تقييم ألفة ارتباط البروتين بالكروماتين.
- تقييم التغيرات في أنماط الارتباط تحت ظروف مختلفة.
النتائج الرئيسية
- تتميز هذه الطريقة بقدرتها الفعالة على توصيف ملفات ارتباط البروتين.
- توضح الطريقة كيف يمكن للعوامل البيئية أن تغير من ألفات الارتباط.
- تشير النتائج إلى فائدة هذه التقنية لكل من الباحثين المتمرسين والمبتدئين على حد سواء.
- توفر رؤى حول تفاعلات المنظمات فوق الجينية مع الكروماتين.
الاستنتاجات
- يعد استخلاص الملح المتسلسل أداة قيمة لدراسة تفاعلات الكروماتين.
- تتميز هذه الطريقة بالكفاءة وسهولة التطبيق في مختلف التطبيقات البحثية.
- تساهم هذه الطريقة في تعزيز فهم ديناميكيات ارتباط البروتين في بيولوجيا الكروماتين.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
يوفر الاستخلاص الملحي المتسلسل (SSE) طريقة سريعة وفعالة من حيث التكلفة لتقييم ألفة البروتينات المرتبطة بالكروماتين، مما يتيح التحقق من الأهداف في المراحل المبكرة من اكتشاف الأدوية التي تركز على علم فوق الجينات. ومن خلال قياس كيفية تأثير الاضطرابات الجينية أو الكيميائية أو البيئية على التفاعلات بين البروتين والكروماتين، يدعم الاستخلاص الملحي المتسلسل تقليل المخاطر الميكانيكية للمعقدات المعدلة للكروماتين قبل البدء في اختبارات تستهلك موارد مكثفة. ويعزز هذا النهج من الثقة التنبؤية في تحديد المركبات الرائدة عن طريق التمييز بين تأثيرات الارتباط المباشر والاستجابات الخلوية غير المباشرة.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: يقيس التغيرات في ألفة الارتباط النسبية عند فقدان الوحدات الفرعية للمعقد أو تعطيل النطاقات، مما يوضح المساهمات الوظيفية للبروتينات الفردية في الارتباط بالكروماتين.
- القيمة العلمية: يحدد أنماط الشطف تحت تركيزات ملحية متزايدة للتمييز بين الارتباط النوعي بالكروماتين والارتباطات غير النوعية، مما يقلل من النتائج الإيجابية الكاذبة في التحقق من الأهداف.
- القيمة التشغيلية: يمكّن غير الخبراء من توليد بيانات ارتباط كمية دون الحاجة إلى خبرة متخصصة في تقنية ChIP، مما يسرع من اختبار الفرضيات في مراحلها المبكرة.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: يُنشئ ملفات شطف قابلة للتكرار تعمل كقراءات كمية لفحص تأثيرات المركبات على تغييرات المشهد الكروماتيني.
- القيمة التشغيلية: يستخدم البنية التحتية القياسية لطريقة "وسترن بلوت" (western blot) وتحليل الصور، مما يسهل توحيد المقايسة عبر المختبرات ويقلل من التباين التقني.
- القيمة التشغيلية: يتطلب فقط معدات الطرد المركزي والترحيل الكهربائي الأساسية، مما يقلل من عوائق الاعتماد في سلاسل الفحص للمعدِّلات فوق الجينية.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- القيمة العلمية: يربط التغيرات في بيئة الكروماتين (على سبيل المثال، عبر مثبطات HDAC) بالتغيرات في ارتباط البروتين، مما يدعم الدراسات الميكانيكية المتوافقة مع المؤشرات الحيوية في الأنظمة ذات الصلة بالأمراض.
- القيمة العلمية: يقيم تحولات الارتباط تحت تأثير الإجهاد الجيني (على سبيل المثال، تلف DNA الناجم عن doxorubicin)، مما يغذي النماذج التنبؤية لارتباط الهدف تحت الظروف الفيزيولوجية المرضية.
- القيمة التشغيلية: يكمل المقايسات الخلوية والكيميائية الحيوية من خلال توفير تحقق متعامد من استمرارية تفاعل الكروماتين من مرحلة الاكتشاف وصولاً إلى المراحل قبل السريرية.
تكامل خطوط المعالجة وسير العمل
يتناسب تقييم ارتباط الحالة الثابتة (SSE) ضمن سلسلة عمليات الاكتشاف بدءاً من التحقق من الهدف وصولاً إلى تحسين المركبات الرائدة، حيث يوفر جسراً ميكانيكياً بين مقاييس الارتباط الكيميائي الحيوي وقراءات المظاهر الخلوية في برامج علم الوراثة فوق الجينية.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم اختبار الفرضيات من خلال القياس الكمي لكيفية تأثير التعديلات المعقدة على ارتباط الكروماتين، مما يسمح بتوضيح المسارات وتقليل المخاطر البيولوجية للأهداف فوق الجينية.
- الفحص: توفر ملفات شطف معتمدة على الملح كمخرجات كمية لمقارنة التغيرات في حالة الكروماتين الناجمة عن المركبات عبر حملات الفحص.
- التحليلات: تولد بيانات كثافة النطاقات المرسومة مقابل تركيز الملح، مما يوفر إزاحات قابلة للحساب في ألفة الارتباط تساهم في مناقشات علاقة البنية بالنشاط.
- الأبحاث الانتقالية: تربط بين تغيرات الارتباط في المختبر وتعديلات مشهد الكروماتين الخلوي، مما يدعم مواءمة المؤشرات الحيوية الانتقالية عند اقترانها بقراءات وظيفية.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تمثل قدرة قياسية منخفضة التكلفة قابلة للتطبيق عبر أهداف كروماتينية متعددة، مما يعزز إعادة استخدام المنصة في مسارات اكتشاف الأدوية فوق الجينية.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة التنبؤية في التحقق من الأهداف من خلال التمييز بين الارتباط المباشر بالكروماتين والتأثيرات الخلوية غير المباشرة عبر عملية شطف الأملاح المتحكم بها.
- القيمة التشغيلية: توفر ملفات ارتباط كمية وقابلة للتكرار باستخدام معدات مخبرية متاحة على نطاق واسع، مما يعزز التوحيد القياسي بين الفرق البحثية.
- القيمة الاستراتيجية: تقلل الاعتماد على تقنية ChIP ذات الإنتاجية المنخفضة في تقييمات الارتباط الأولية، مما يحسن كفاءة رأس المال في مشاريع علم فوق الجينات المبكرة.
- تأثير المحفظة: تتيح تحديد أولويات أهداف مجمعات تعديل الكروماتين بناءً على تعديل المخاطر، وذلك استناداً إلى مرونة الارتباط الكمي تجاه الاضطرابات البيئية.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في الكيمياء الحيوية للكروماتين وتقدير كميات لطخة ويسترن لضمان التفسير الدقيق لملف الشطف.
- يعتمد على توفر أجهزة طرد مركزي مبردة، وأنابيب طرد مركزي دقيقة، وأدوات قياسية للفصل الكهربائي للهلام بوجود كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS-PAGE) ولطخة ويسترن.
- يستلزم اتباع بروتوكولات موحدة لحصاد الخلايا وتحللها لتقليل التباين بين العينات وضمان الحصول على نتائج استخلاص أملاح قابلة للمقارنة.
- يتضمن تحسين أوقات الحضانة لكل بروتين مستهدف، نظراً لاختلاف حركية تحرير الارتباط عبر معقدات تعديل الكروماتين.
- يقتصر على مقارنات الألفة النسبية؛ حيث تتطلب ثوابت الارتباط المطلقة طرقاً بيوفيزيائية متعامدة للتحقق من صحتها.
