تحليل الخلايا الليمفاوية التسرب باستخدام في المختبر نموذج من الدم في الدماغ الإنسان الحاجز

الهدف العام من مقايسة التحويل هذا هو التحقيق في تسرب الخلايا الليمفاوية إلى الجهاز العصبي المركزي في المختبر. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في تعزيز فهمنا للأمراض الالتهابية للجهاز العصبي المركزي وفي تطوير مناهج علاجية جديدة. تتمثل بعض مزايا هذه التقنية في سهولة الوصول إليها وأنها تسمح بتحليل مجموعات الخلايا الليمفاوية النادرة على مستوى الخلية الواحدة.

يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة على انتقال الخلايا الليمفاوية عبر الحاجز الدموي الدماغي ويمكن تطبيقها على دراسة التحول عبر حاجز السائل الدموي النخاعي. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن إجراء تحليل نفاذية إيفانز الزرقاء لتقييم سلامة نموذج الحاجز الدموي الدماغي. ابدأ بتغطية الجزء السفلي من قارورة ثقافة الخلايا T-25 بملليلترين من محلول الفيبرونيكتين المحضر حديثا لمدة ثلاث ساعات على الأقل في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

في نهاية الحضانة ، استبدل محلول الفيبرونيكتين ب 7.2 في 10 إلى الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة الرابعة للدماغ البشري ، أو HBMEC ، في ستة ملليلتر من وسط ECM-b الكامل ، وأعد القارورة إلى الحاضنة. عندما يصل HBMEC إلى التقاء 80٪ ، انقل المادة الطافية إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر ، واغسل الخلايا الملتصقة ثلاث مرات بخمسة ملليلتر من PBS. بعد الغسيل الثالث ، أضف ملليلترين من محلول Accutase الدافئ مسبقا إلى الخلايا لمدة دقيقتين عند 37 درجة مئوية.

ثم اضغط بقوة على القارورة عدة مرات ، لتأكيد انفصال الخلية عن طريق الفحص المجهري الضوئي. عندما تبدأ الخلايا في الرفع من قاع القارورة، استخدم المادة الطافية المحصودة لشطف القارورة بشكل متكرر حتى يتم إعادة تعليق معظم HBMEC. ثم انقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر للطرد المركزي ، وأعد تعليق الحبيبات في مليلتر واحد من وسط ECM-b الطازج للعد.

لتحضير إدخالات ثقافة الخلايا لمقايسة التحويل ، أضف أولا 100 ميكرولتر من محلول الفيبرونيكتين إلى كل ملحق وإلى بئر واحد من صفيحة مسطحة ذات 96 بئرا. بعد ثلاث ساعات عند 37 درجة مئوية ، استبدل محلول الفبرونيكتين ب 100 ميكرولتر من HBMEC ، وأضف 600 ميكرولتر من وسط ECM-b الطازج إلى الأجزاء السفلية من إدخالات زراعة الخلايا. ثم أعد الألواح إلى حاضنة زراعة الخلايا لمدة ثلاثة إلى أربعة أيام.

لاختبار ما إذا كان قد تم الوصول إلى سلامة الحاجز ، قم بشفط الوسط من المقصورات السفلية والعلوية لإدراج ثقافة خلية واحدة ، وأضف 100 ميكرولتر من محلول إيفانز الأزرق المحضر حديثا إلى الملحق. أضف 600 ميكرولتر من PBS المكمل ب B27 إلى المقصورة السفلية ، وأعد اللوحة إلى الحاضنة. بعد ساعة واحدة ، استخدم الملقط لإزالة الملحق بعناية ، وانقل 100 ميكرولتر من PBS B27 من المقصورة السفلية إلى بئرين فرديين من صفيحة سوداء من البوليستيرول و96 بئرا مسطحة القاع.

ثم قم بتحميل اللوحة في قارئ صفيحة دقيقة متعدد الأوضاع ، وحدد الموضع الأمثل z. لتحديد دالة حاجز HBMEC ، قم بقياس إثارة محلول صبغة إيفانز الزرقاء باستخدام الإعدادات المناسبة ، وقارن البيانات المكتسبة بمنحنى قياسي يصور نفاذية إيفانز الزرقاء عبر HBMEC في نقاط زمنية مختلفة بعد البذر. بعد تأكيد تكوين طبقة أحادية الخلية ، أعد تعليق عينة الخلية أحادية النواة للدم المحيطي ، أو PBMC ، إلى خمسة أضعاف 10 إلى الخلايا السادسة لكل تركيز مليلتر في وسط RPMI المكمل ب B27.

بعد ذلك ، قم بشفط الوسط من المقصورات السفلية والعلوية للعدد المناسب من إدخالات زراعة الخلايا التي تحتوي على طبقات أحادية HBMEC المتقاربة ، وأضف 100 ميكرولتر من PBMC لكل متبرع إلى إدخالات زراعة الخلايا وإلى بئر واحد من صفيحة 24 بئرا لكل عنصر تحكم في المختبر. أضف 600 ميكرولتر من RPMI بالإضافة إلى B27 إلى الأجزاء السفلية لإدخالات زراعة الخلايا و 500 ميكرولتر إلى آبار التحكم في المختبر ، وأعد الألواح إلى حاضنة زراعة الخلايا لمدة ست ساعات. في نهاية الحضانة ، استخدم الملقط لإزالة إدخالات ثقافة الخلايا ، واشطف القيعان بعناية ب 400 ميكرولتر من PBS دون لمس الأغشية.

ثم امزج جيدا 20 ميكرولترا من الغلاف الفلوري Flow-Count مع الخلايا الموجودة في آبار التحكم التجريبية وفي المختبر ، وانقل ملليلتر واحد من معلقات PBMC الناتجة إلى أنابيب قياس التدفق الخلوي المناسبة. اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي ، وأضف الأجسام المضادة المترافقة بالفلوروكروم ذات الأهمية في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت لقياس التدفق الخلوي لكل عينة. بعد 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية ، اغسل الخلايا ب 250 ميكرولتر من المخزن المؤقت لقياس التدفق الخلوي الطازج ، وأعد تعليق الكريات في الحجم المناسب من المخزن المؤقت لقياس التدفق الخلوي للتحليل.

عندما يتم الحصول على جميع البيانات ، افتح برنامج تحليل قياس التدفق الخلوي المناسب. لتحليل انتقال المجموعة الفرعية للخلايا القاتلة الطبيعية ، حدد أولا الخلايا الليمفاوية في مخطط قناة مبعثر جانبية مقابل أمامية ، واعرض الخلايا في مخطط نقطي CD3 مقابل CD56. ثم حدد خلايا NK الإيجابية CD56 والسلبية CD3.

للتمييز بين المجموعات الفرعية لخلايا NK المنقولة ، اعرض الخلايا في مخطط CD56 مقابل CD16 وبوابة للخلايا CD56bright أو CD16dim أو السلبية و CD56dim و CD16 الإيجابية. ثم حدد الغلاف الفلوري لعدد التدفق من مخطط مبعثر أمامي مقابل جانبي. لتحديد رقم الخرزة ، اعرض البيانات المحددة في مخطط لقناة تغطي طول موجة انبعاث يتراوح بين 525 و 700 نانومتر مقابل الوقت.

أخيرا ، حدد النسبة المئوية لخلايا NK المهاجرة كنسبة بين العدد الإجمالي للخلايا المهاجرة والعدد الإجمالي للخلايا في التحكم في المختبر. بعد ثلاثة إلى أربعة أيام من الثقافة ، عبر HBMEC عن جزيء الوصلة الضيقة Zonula occludens-1 وينمو في طبقات أحادية تظهر مقاومة كهربائية عبر البطانة وتقلل من تغلغل صبغة إيفانز الزرقاء. يؤدي تحفيز الطبقة الأحادية للخلية البطانية مع إنترفيرون جاما ونخر الورم ألفا لمدة 24 ساعة قبل إجراء اختبار تحويل PBMC بالكامل إلى زيادة هجرة جميع مجموعات الخلايا الليمفاوية التي تم تحليلها.

ومن المثير للاهتمام أن خلايا CD56bright أو CD16dim أو الخلايا القاتلة الطبيعية السالبة تظهر قدرة هجرة أعلى من CD56dim ، NK الإيجابية CD16 عبر كل من HBMEC غير المحفز والمنشط بالسيتوكين. على الرغم من أن الزيادة النسبية في التحول من خلال طبقة أحادية الخلية الملتهبة أعلى بالنسبة لخلايا CD56dim بشكل عام ، إلا أنها تحاكي الملاحظات في الجسم الحي التي تفيد بأن خلايا CD56bright و CD16dim-negative NK يتم إثرائها في المقصورة داخل القراب. يمكن إتقان هذه التقنية في غضون 10 ساعات.

المعالجة المسبقة لإعداد الترحيل في المختبر باستخدام الإنترفيرون جاما ونخر الورم ألفا دراسة هجرة الخلايا الليمفاوية في ظل الظروف الالتهابية. يمكن تعديل بروتوكولنا عن طريق تطبيق قوى القص أو عن طريق الزراعة المشتركة مع الخلايا الأخرى للحاجز الدموي الدماغي ، مثل الخلايا النجمية ، لتوفير نموذج مكرر لانتقال الخلايا الليمفاوية إلى الجهاز العصبي المركزي. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية التحقيق في انتقال الخلايا الليمفاوية باستخدام نموذج في المختبر للحاجز الدموي الدماغي البشري.