Name: تحليل الخلايا الليمفاوية التسرب باستخدام في المختبر نموذج من الدم في الدماغ الإنسان الحاجز (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: اكتشف تحليل انتقال الخلايا الليمفاوية عبر حاجز الدم في الدماغ البشري في المختبر. تتيح هذه الطريقة دراسة آليات الالتهابات العصبية وتطوير استراتيجيات علاجية جديدة بدقة عالية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

تم دعم هذه الدراسة من قبل مركز البحوث التعاونية CRC TR128 "بدء / المستجيب مقابل الآليات التنظيمية في التصلب المتعدد - التقدم نحو معالجة المرض" (المشروع A9 إلى H.W. و CCG ، المشروع B1 إلى NS.).

1. خلية ثقافة الدماغ البشري خلايا الاوعية الدموية الدقيقة البطانية (HBMEC) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طلاء قوارير زراعة الخلايا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإعداد حل فبرونيكتين، إضافة 10 مل PBS إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل. إضافة 150 ميكرولتر فبرونيكتين وتخلط جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتغطية الجزء السفلي من T-25 زراعة الخلايا قارورة إضافة 2 مل من محلول فبرونيكتين. احتضان القارورة ثقافة الخلية لا يقل عن 3 ساعات في 37 درجة مئوية في الحاضنة. فبرونيكتين المغلفة قوارير يمكن تخزينها لمدة 2 أسابيع في 37 ° C / 5٪ CO 2. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البذر والغرس وزراعة الخلايا من HBMEC <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح الحل فبرونيكتين من أسفل القارورة ثقافة الخلية. إضافة 7.2 × 10 4 HBMEC / سم ² مع وقف التنفيذ في 6 مل ECM-ب المتوسطة (= ECM-ب تستكمل مع 5٪ مصل بقري جنيني، 1٪ البنسلين / الستربتومايسين، و 1٪ البطانية تكملة نمو الخلايا). احتضان عند 37 ° C / 5٪ CO 2. تحقق نمو الخلايا يوميا باستخدام المجهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغيير المتوسط ​​كل 3 أيام.الحصاد أو خلايا تقسيم، عندما HBMEC تصل إلى ما يقرب من 80٪ التقاء. وينبغي أن تستخدم HBMEC بين مرور 1 و 15 لتجنب فقدان الخصائص الفيزيولوجية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حصاد HBMEC. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد accutase حل عن طريق خلط accutase (1X) مع PBS في نسبة 1: 1. الحفاظ accutase الحل عند 37 درجة مئوية في حمام مائي حتى استخدامها مرة أخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل ECM-ب المتوسطة من القارورة ثقافة الخلية إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل. غسل HBMEC بإضافة 5 مل PBS إلى أسفل القارورة ثقافة الخلية. نضح PBS وكرر الخطوة غسل مرتين أخريين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة استعد قبل 2 مل accutase الحل. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة. بعد ذلك، HBMEC يتم إعادة وقف التنفيذ من خلال استغلال بقوة قارورة ثقافة الخلية عدة مرات. يتم التحكم مفرزة الخلية باستخدام المجهر </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم إضافة ECM-ب-المتوسطة المخزنة مسبقا في أنبوب 15 مل إلى قارورة زراعة الخلايا بمجرد بدء HBMEC إلى فصل. شطف أسفل القارورة بشكل متكرر حتى معظم HBMEC هيإعادة وقف التنفيذ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل تعليق خلية إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل. أجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تجاهل طاف واعادة تعليق الخلايا في 1 مل ECM-ب متوسطة. عد الخلايا وتمييع تعليق الخلية لتحقيق تركيز النهائي من 3 × 10 5 HBMEC لكل مليلتر ECM-ب متوسطة. </li></ol></li></ol> 2. إعداد خلية ثقافة إدراجات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طلاء من إدراج خلية ثقافة ملاحظة هامة: تجنب لمس الغشاء من إدراج ثقافة الخلية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرولتر حل فبرونيكتين (انظر 1.1.1) إلى كل إدراج ثقافة خلية (الشكل 1A) وبئر واحدة من 96-جيدا لوحة مسطحة القاع (مراقبة البصرية أيضا). احتضان لمدة لا تقل عن 3 ساعات في 37 ° C. بعد حل حضانة نضح فبرونيكتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرولتر HBMEC تعليق على إدراج ثقافة الخلية والتحكم البصري أيضا. إضافة 600 ميكرولتر ECM-ب متوسطة إلى المقصورة أقل من الخليةإدراج الثقافة. احتضان لمدة 3-4 أيام عند 37 درجة مئوية / 5٪ CO 2 حتى سلامة الحاجز (الشكل 1B) يتم التوصل، تحقق نمو الخلايا عن طريق التقييم المجهري للHBMEC في السيطرة البصرية أيضا. ملاحظة: لا ينصح نمو الخلية وراء أربعة أيام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختياري: لتحاكي حالات الالتهاب نضح المتوسطة من مقصورة الدنيا واستبدالها ECM-ب المتوسطة تستكمل مع 500 U / مل IFN-γ / TNF-α 24 ساعة قبل الفحص الهجرة. </li></ol></li></ol> 3. مراقبة الجودة مع ايفانز الأزرق يوم من الفحص التهجير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد إيفانز حل الأزرق <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإعداد PBS / B27 مزيج حل 10 مل PBS مع 200 ميكرولتر ملحق B27 باستخدام أنبوب الطرد المركزي 15 مل. تمييع ايفانز الأزرق حل سهم (20 ملغ / مل PBS) 1: 1000 مع PBS / B27. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ايفانز الأزرق نفاذية فحص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح في المتوسط ​​من المقصورة أقل تليها المقصورة العليامن إدراج الثقافة خلية واحدة تحتوي على متكدسة HBMEC أحادي الطبقة. إضافة 100 ميكرولتر إيفانز حل الأزرق لإدراج الثقافة الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 600 ميكرولتر PBS / B27 إلى المقصورة الدنيا واحتضان لمدة 60 دقيقة عند 37 ° C / 5٪ CO 2. إزالة بعناية إدراج الثقافة الخلية باستخدام ملقط. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ايفانز قياس الأزرق <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة PBS / B27 من مقصورة الدنيا ونقل 100 ميكرولتر كل لبئرين من polystyrol الأسود 96-جيدا لوحة مسطحة القاع. إدراج لوحة في TECAN اللانهائي M200 القارئ برو لوحة وتحديد الأمثل ض الموقف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الإثارة قدر من ايفانز الزرقاء باستخدام إعدادات منها (على سبيل المثال: الإثارة: 620 نانومتر، والانبعاثات: 680 نانومتر، وعرض النطاق الترددي الإثارة: 9 نانومتر، عرض النطاق الترددي الانبعاثات: 20 نانومتر، وتعزيز 175x 25 ومضات، والوقت من التكامل: 20 ميكرو ثانية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحديد وظائف حاجز HBMEC قارن حصلت البيانات إلى منحنى القياسية التي تصور إيفانز تخلل الأزرق عبر HBMEC في نقاط زمنية مختلفة بعد البذورجي الخلايا (الشكل 1B، يمين). </li></ol></li></ol> 4. هجرة الفحص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الخلايا وحيدة النواة الدموية المحيطية (PBMC). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 10 مل RPMI في أنبوب 15 مل الطرد المركزي وإضافة 200 ميكرولتر B27 الملحق. عد الخلايا PBMC وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق. اعادة تعليق PBMC إلى التركيز النهائي من 5 × 10 6 خلية / مل RPMI / B27. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انشاء لفحص الهجرة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح المتوسطة من المقصورة أقل تليها المقصورة العليا من إدراج ثقافة الخلية التي تحتوي متموجة HBMEC الطبقات الوحيدة (الشكل 1A). لكل المانحة إضافة 100 ميكرولتر PBMC تعليق كل لإدراج زراعة الخلايا وكذلك لبئر واحدة من 24 لوحة جيدا في المائة (في المختبر السيطرة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 600 ميكرولتر RPMI / B27 إلى المقصورة السفلية من إدراج ثقافة الخلية و 500 ميكرولتر إلى PBMC للتحكم في المختبر واحتضان 6 ساعة عند 37 ° C / 5٪ CO 2. </lط&gt; </ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حصاد ترحيله PBMC <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إخراج إدراج الثقافة الخلية باستخدام ملقط وشطف بعناية أسفل مع 400 ميكرولتر PBS دون لمس الغشاء. تجاهل إدراج الثقافة الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 20 ميكرولتر fluorospheres عدد التدفق (حوالي 1000 الخرز / ميكرولتر) إلى حجرة الأدنى من الثقافة خلية تضاف كذلك إلى عنصر التحكم في المختبر، وتخلط جيدا. نقل 1 مل من الناتج PBMC تعليق إلى التدفق الخلوي الأنابيب. </li></ol></li></ol> 5. التدفق الخلوي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد عينة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي PBMC في 300 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل الضد بإضافة الأجسام المضادة تألقي مترافق إلى 100 ميكرولتر التدفق الخلوي عازلة (PBS / 1٪ BSA / 2 ملي EDTA) لكل عينة. للحصول على نتائج عرض أقل من 1 ميكرولتر CD4-FITC، استخدمت 1 μLCD3-PerCP / Cy5.5، 1 ميكرولتر CD56-PC7، 1 ميكرولتر CD8-A700، و 1 ميكرولتر CD16-A750 في العينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تعليق PBMC في 100 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة واحتضان لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 250 ميكرولتر التدفق الخلوي العازلة وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اكتساب عينة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اعادة تعليق PBMC في المبلغ المطلوب (قد تختلف تبعا لقياس التدفق الخلوي المستخدمة) من التدفق الخلوي العازلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول الملون PBMC باستخدام قياس التدفق الخلوي مع كاشف النشط بين 525 و 700 نانومتر الطول الموجي للكشف عن fluorospheres عدد التدفق (الإثارة 488 نانومتر، وانبعاث 525-700 نانومتر). (الخطوات التالية هي مثال إذا تم استخدام تدفق Gallios عداد الكريات تعمل مع برنامج Kaluza G: (1) بدء تشغيل الكمبيوتر (2) عند تحميل نظام التشغيل بالكامل، وبدء قياس التدفق الخلوي عن طريق الضغط على &quot;عداد الكريات على&quot; الزر (3) تحميل بروتوكول اكتساب منها عن طريق الضغط على زر &quot;بروتوكول مفتوحة&quot;. (4) اختر البروتوكول المطلوب وحدد &quot;فتح&quot;. (5) مكررة بروتوكول لكل عينة عن طريق النقر على الحقزر الماوس على بروتوكول مرئية في دائري الظاهري واليسار انقر على حقل &quot;مكررة&quot;. (6) تسمية كل عينة في قائمة العينة. (7) نقل العينات إلى المواقع المحددة من دائري والبدء في عملية الاستحواذ.) </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل عينة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح التدفق الخلوي مما يؤدي البيانات باستخدام البرنامج منها. تحديد عدد من القطعان التي تهم transmigrated PBMC وكذلك خلايا في المختبر من آبار المراقبة وتدفق fluorospheres العد باستخدام برامج التحليل المعنيين. (تم اعطاء مثال للاستراتيجية المعزولة في الجزء النتائج (الشكل 1 C: تحليل التهجير من مجموعات فرعية NK الخلية، أولا تحديد الخلايا الليمفاوية في قناة مبعثر sideward (SSC) مقابل قناة مبعثر إلى الأمام (FSC) مؤامرة الخلايا اللمفاوية هي. ثم عرض في CD3 مقابل CD56 CD56 + المؤامرة وCD3 - يتم اختيار خلايا NK للتمييز بين مجموعات فرعية NK الخلية، يتم عرض الخلايا القاتلة الطبيعية فيويتم اختيار وكذلك CD56 CD16 + قاتمة خلايا NK - على CD56 CD16 مقابل المؤامرة وCD56 CD16 مشرق خافت /. وبالإضافة إلى ذلك، يتم تحديد fluorospheres عدد التدفق من FSC مقابل SSC مؤامرة وبعد ذلك عرض في مؤامرة لقناة مع الانبعاثات بين 525 و 700 نانومتر مقابل الوقت لتحديد عددهم.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لحساب عدد الخلايا الكلي لكل عينة، وتطبيع عدد الكشف عن الخلايا باستخدام fluorospheres عدد التدفق: <img alt="معادلة" src="/files/ftp_upload/55390/55390eq1.jpg" /></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد النسبة المئوية للخلايا هاجر كما النسبة بين مجموع الخلايا هاجروا ومجموع الخلايا في عنصر التحكم في المختبر. </li></ol></li></ol>

أعلن المؤلف (المؤلفون) عن تضارب المصالح المحتمل التالي فيما يتعلق بالبحث و / أو التأليف و / أو نشر هذه المقالة: A.S.-M. و U.B. ليس لديها إفصاحات مالية. تي إس إتش. استلم نفقات السفر والمؤتمرات من Biogen. حصلت NS على متحدث وأتعاب المجلس الاستشاري من Biogen و Novartis Pharma ، بالإضافة إلى نفقات السفر من Biogen. حصل إتش دبليو على تعويض عن عمله في المجالس الاستشارية العلمية / اللجان التوجيهية لشركة باير للرعاية الصحية ، وبيوجين ، وميرك سيرونو ، ونوفارتيس ، وسانوفي جينزيم. كما حصل على أتعاب المتحدثين ودعم السفر من Bayer Vital GmbH و Bayer Schering AG و Biogen و CSL Behring و Fresenius Medical Care و Glaxo Smith Kline و GW Pharmaceuticals و Lundbeck و Merck Serono و Omniamed و Novartis و Sanofi-Genzyme. حصل على تعويض كمستشار من Biogen و Merck Serono و Novartis و Sanofi-Genzyme. تلقى H.W. دعما بحثيا من Bayer Vital و Biogen و Genzyme و Merck Seronto و Novartis و Sanofi-Aventis Germany و Sanofi US. حصلت CCG على أتعاب المتحدث ونفقات السفر لحضور الاجتماعات من Genzyme و Novartis Pharma GmbH و Bayer Health Care.

هنا نقدم تقنية للتحقيق في التهجير من الخلايا الليمفاوية عبر حاجز الدم في الدماغ البشري. في تحليل المختبر الهجرة اللمفاويات إلى الجهاز العصبي المركزي هو مهم لدراسة العمليات الأساسية للتسرب الخلايا اللمفاوية، والتعديلات المحتملة المتعلقة بالمرض، وطرق علاجية جديدة. العديد من التعديلات من طراز حاجز الدم في الدماغ ممكنة. على سبيل المثال، يمكن تحليل الخلايا من المقصورة العليا للتحقيق في التركيبة السكا...

اللمفاويات الهجرة من الدم إلى الأنسجة أمر بالغ الأهمية لمراقبة المناعية. A سلسلة من التفاعلات الجزيئية محددة يضمن موقع التسرب معين في الأمعاء الدقيقة، والجلد والغدد الليمفاوية، والجهاز العصبي المركزي (CNS)، وغيرها من الأنسجة 1. وتشارك التعديلات في الهجرة لمفاوية في الفيزيولوجيا المرضية لعدد من الأمراض واسعة الانتشار 2. الهجرة إلى الجهاز العصبي المركزي المناعة متميز ينظم بإحكام وفقا لذلك تشارك التعديلات لهذه العملية في الأمراض المتصلة الجهاز العصبي المركزي مثل التهاب الدماغ والنخاع 3، البصري التهاب النخاع و الأعصاب، والسكتة الدماغية، والتصلب المتعدد (MS) 2، 4، 5، 6، 7. وبالتالي، فمن المهم دراسة لمفاوية تسرب إلى فهم أفضل الفيزيولوجيا المرضية المرض وتطوير أدوات ل<html> تحسين الاراضي من عبء المرض 8، 9، 10، 11، 12. الخلايا الليمفاوية تهاجر إلى الجهاز العصبي المركزي عبر طرق مختلفة. وقد وصفت التسرب من خلال الأوردة للشعيرات في الفضاء تحت العنكبوتية عبر حاجز السوائل الدم النخاعي داخل الضفيرة المشيمية وعبر حاجز الدم في الدماغ 1 و 13 و 14 و 15. تتم الهجرة عبر حاجز الدم في الدماغ عن طريق التفاعل بين الخلايا الليمفاوية مع الخلايا البطانية 14. وعلى النقيض من الخلايا البطانية في محيط الخلايا البطانية من CNS تعبر عن كميات عالية من جزيئات تقاطع ضيقة، مما يحد بدقة كمية من الخلايا والبروتينات قادرة على عبور حاجز الدم في الدماغمعشوقة = &quot;XREF&quot;&gt; 16. النتائج التهاب في تخفيف منعطفات ضيقة ويستحث التعبير عن جزيئات الالتصاق. وبالتالي، تعزيز الهجرة لمفاوية في الجهاز العصبي المركزي 1 و 17 و 18. تسرب عبر حاجز الدم في الدماغ هو عملية متعددة الخطوات. الخلايا اللمفية الحبل على الخلايا البطانية ثم لفة طول البطانة في عملية بوساطة أساسا selectins 1، 15. وفي وقت لاحق، والتفاعلات بين كيموكينات التي يفرزها البطانة والمستقبلات chemokine منهما أعرب عن الخلايا الليمفاوية تحدث تغييرات بتكوين لintegrins، وبالتالي تعزيز التصاق الثابت الخلايا البطانية 1. وأخيرا، الخلايا اللمفية إما الزحف على طول حاجز غشائي ضد تدفق الدم قبل transmigrating في الفضاء المحيط بالأوعية، أو المماطلة فورا ومباشرة نقل الحركةigrate في موقع شركة التصاق 1 و 19 و 20. ويمكن تحليل كل هذه الخطوات من تسرب الخلايا اللمفاوية في المختبر باستخدام تقنيات متميزة 21. ويستخدم الوقت الفاصل بين الفيديو المجهر لدراسة الربط الأولي والمتداول 15. توفر فحوصات التصاق معلومات مفصلة حول اعتقال الراسخ البطانية الحواجز 22. فحوصات التهجير كما هو موضح هنا تسمح بتحليل خلايا المناعة التهجير 21، 23، 24، 25، 26، 27، 28، 29. باستخدام البشرية في الدم في المختبر نموذج حاجز الدماغ، ونحن يمكن أن تظهر في الآونة الأخيرة أن migr العاليالقدرة atory من CD56 CD16 مشرق قاتمة / - خلايا NK مقارنة CD56 خافت انعكس CD16 + نظرائهم من غلبة هذا فرعية الخلايا القاتلة الطبيعية في حجرة داخل القراب 21. وبالتالي، فإن الإعداد التجريبية يبدو أن تكون مناسبة لمحاكاة الوضع في الجسم الحي.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td>بدون CaCl 2 أو MgCl 2</td></tr> <tr><td>Fibronectin 1 مجم / مل</td><td>Sigma</td><td>F1141-5MG</td><td>من قارورة زراعة الخلايا T-25 البلازما</td></tr><tr><td></td><td>البقرية Greiner BioOne</td><td>690160</td><td></td></tr><tr><td>HBMEC</td><td>ScienCell</td><td>1000</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Pelobiotech</td><td>PB-H-6023</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Sigma</td><td>A6964-100ML</td><td></td></tr><tr><td>ECM-b</td><td>ScienCell</td><td>1001-b</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>ScienCell</td><td>1001-b</td><td></td></tr><tr><td>البنسلين / الستربتومايسين</td><td>ScienCell</td><td>1001-b</td><td></td></tr><tr><td>مكمل نمو الخلايا البطانية</td><td>ScienCell</td><td>1001-b</td><td></td></tr><tr><td>Transwell</td><td>Corning</td><td>3472</td><td>واضح ، قطر 6.5 مم ، 3.0 & الصغيره; م حجم المسام</td></tr><tr><td>96 بئر لوحة سفلية مسطحة</td><td>Corning</td><td>3596</td><td></td></tr><tr><td>إيفانز الأزرق</td><td>Sigma</td><td>E2129-10G</td><td>حل الأسهم: 1 جم / 50 مل PBS</td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td>50x مركز</td></tr><tr><td>Infinite M200Pro</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 جيدا لوحة قاع مسطح</td><td>سوداء Greiner BioOne</td><td>675086</td><td></td></tr><tr><td>48 بئر</td><td>Corning</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>61870-010</td><td></td></tr><tr><td>عدد التدفق الفلوروسفير</td><td>بيكمان كولتر</td><td>7547053</td><td></td></tr><tr><td>Na-EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Gallios مقياس التدفق الخلوي 10 ألوان</td><td>بيكمان كولتر</td><td></td><td></td></tr><tr><td>كالوزا 1.5a</td><td>بيكمان كولتر</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TNF- & ألفا;</td><td>Peprotech</td><td>300-01A</td><td></td></tr><tr><td>IFN-& gamma;</td><td>استنساخ Peprotech</td><td>300-02</td><td></td></tr><tr><td>CD3-PerCP / Cy5.5</td><td>Biolegend</td><td>300430</td><td>استنساخ UCHT1</td></tr><tr><td>CD56-PC7</td><td>استنساخ بيكمان كولتر</td><td>A21692</td><td>استنساخ N901</td></tr><tr><td>CD16-A750</td><td>استنساخ بيكمان كولتر</td><td>A66330</td><td>استنساخ 3G8</td></tr><tr><td>CD4-FITC</td><td>Biolegend</td><td>300506</td><td>استنساخ RPA-T4</td></tr><tr><td>CD8-A700</td><td>استنساخ بيكمان كولتر</td><td>A66332</td><td>استنساخ B9.11</td></tr></tbody></table>

تحليل الخلايا الليمفاوية التسرب باستخدام<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج من الدم في الدماغ الإنسان الحاجز

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

لمفاوية تسرب في النظام العصبي المركزي (CNS) أمر بالغ الأهمية لمراقبة المناعية. التعديلات المتعلقة مرض تسرب الخلايا اللمفاوية قد يؤدي إلى تغيرات الفيزيولوجية المرضية في الجهاز العصبي المركزي. وهكذا، والتحقيق في هجرة الخلايا اللمفاوية في الجهاز العصبي المركزي مهم لفهم الأمراض CNS التهابات وتطوير طرق العلاج الجديدة. هنا نقدم نموذجا في المختبر من حاجز الدم في الدماغ البشري لدراسة الخلايا اللمفاوية التسرب. تزرع الاوعية الدموية الدقيقة في الدماغ البشري الخلايا البطانية (HBMEC) confluently على البولي ايثلين مسامية transwell إدراج لتقليد البطانة من حاجز الدم في الدماغ. التحقق من صحة ظيفة الحاجز من قبل نطيقة النطيقة المناعية، والمقاومة الكهربائية transendothelial (طير) القياسات وكذلك تحليل إيفانز تخلل الأزرق. هذا النموذج يسمح التحقيق في انسلال من مجموعات فرعية لمفاوية نادرة مثل CD56 CD16 مشرق قاتمة / - خلايا NK. Furthermخام، وآثار الخلايا الأخرى، السيتوكينات و chemokines، التعديلات المتعلقة بالمرض، ونظم العلاج واضحة على قدرة المهاجرة من الخلايا الليمفاوية يمكن دراستها. وأخيرا، فإن تأثير محفزات للالتهابات وكذلك نظم العلاج المختلفة على حاجز غشائي يمكن تحليلها.

وتظهر نتائج الممثل تظهر التهجير من NK خلايا ومجموعات فرعية T-خلية باستخدام البشري الدم في الدماغ نموذج الحاجز (الشكل 1A). تم التحقق من صحة سلامة أحادي الطبقة HBMEC قبل تلطيخ من مفترق الطرق جزيء ضيق المقاومة الكهربائية القياسات (طير) transendothelial ZO-1، وإيفانز تخلل الأزرق (الشكل 1B). وبعد 3-4 أيام وأعرب ثقافة HBMEC وضيق تقاطع جزيء ZO-1 (الشكل 1B، يسار). وعلاوة على ذلك، نمت HBMEC في الطبقات الوحي...

هنا ، نصف نموذج الحاجز الدموي الدماغي البشري الذي يتيح التحقيق في انتقال الخلايا الليمفاوية إلى الجهاز العصبي المركزي في المختبر.

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

الهدف العام من مقايسة الهجرة عبر الغشاء هذه هو استقصاء خروج الخلايا اللمفاوية إلى الجهاز العصبي المركزي في المختبر. ويمكن أن تساعد هذه الطريقة في تعزيز فهمنا للأمراض الالتهابية التي تصيب الجهاز العصبي المركزي وفي تطوير نهج علاجية جديدة. ومن مزايا هذه التقنية سهولة الوصول إليها وإمكانية تحليل المجموعات النادرة من الخلايا اللمفاوية على مستوى الخلية الواحدة.يمكن أن توفر هذه الطريقة رؤية متعمقة حول انتقال الخلايا اللمفاوية عبر الحاجز الدموي الدماغي، كما يمكن تطبيقها لدراسة الانتقال عبر الحاجز الدموي السائل الدماغي الشوكي. بالإضافة إلى ذلك، يمكن إجراء تحليل نفاذية صبغة إيفانز الزرقاء (Evans blue) لتقييم سلامة نموذج الحاجز الدموي الدماغي. ابدأ بتغطية قاع قارورة زراعة خلايا T-25 بمقدار 2 mL من محلول الفيبرونيكتين (fibronectin) المُحضّر حديثاً، مع التحضين لمدة ثلاث ساعات على الأقل في حاضنة زراعة خلايا عند 37 °C و5% carbon dioxide.في نهاية فترة الحضن، استبدل محلول الفبرونكتين بـ 7.2 × 10⁴ من الخلايا البطانية للأوعية الدموية الدقيقة في الدماغ البشري، أو HBMEC، في 6 mL من وسط ECM-b الكامل، وأعد القارورة إلى الحاضنة. عندما تصل خلايا HBMEC إلى درجة تلاحم بنسبة 80%، انقل السائل الطافي إلى أنبوب مخروطي سعة 15 mL، واغسل الخلايا الملتصقة ثلاث مرات باستخدام 5 mL من PBS. بعد الغسلة الثالثة، أضف 2 mL من محلول Accutase المُسخن مسبقاً إلى الخلايا لمدة دقيقتين عند 37 °C.ثم انقر على الدورق بقوة عدة مرات، مع التأكد من انفصال الخلايا باستخدام المجهر الضوئي. عندما تبدأ الخلايا في الارتفاع عن قاع الدورق، استخدم السائل الطافي المجموع لشطف الدورق بشكل متكرر حتى يتم إعادة تعليق معظم خلايا HBMEC. بعد ذلك، انقل معلق الخلايا إلى أنبوب مخروطي سعة 15 milliliter من أجل الطرد المركزي، وأعد تعليق الراسب في 1 milliliter من وسط ECM-b الطازج لغرض العد.لتحضير غشائـات استنبات الخلايا من أجل مقايسة الانتقال الخلوي، ابدأ بإضافة 100 µL من محلول الفيبرونيكتين إلى كل غشاء وإلى بئر واحد من طبق مسطح القاع مكون من 96 بئراً. وبعد مرور ثلاث ساعات عند درجة حرارة 37 °C، استبدل محلول الفيبرونيكتين بـ 100 µL من خلايا HBMEC، وأضف 600 µL من وسط ECM-b الطازج إلى الحجرات السفلية لغشائـات استنبات الخلايا. ثم أعد الأطباق إلى حضانة استنبات الخلايا لمدة تتراوح بين ثلاثة إلى أربعة أيام.لاختبار ما إذا كان قد تم الوصول إلى سلامة الحاجز، اسحب الوسط من الحجرتين السفلية والعلوية لأحد مداخل زراعة الخلايا، وأضف 100 µL من محلول Evans blue المحضر حديثاً إلى المدخل. أضف 600 µL من PBS المكمل بـ B27 إلى الحجرة السفلية، وأعد الطبق إلى الحاضنة. بعد ساعة واحدة، استخدم ملقطاً لإزالة المدخل بعناية، وانقل 100 µL من PBS B27 من الحجرة السفلية إلى بئرين منفصلين في طبق أسود من البوليسترين مكون من 96 بئراً ذات قاع مسطح.ثم ضع الطبق في قارئ الأطباق الدقيقة متعدد الأنماط، وحدد موضع z الأمثل. ولتحديد وظيفة حاجز HBMEC، قم بقياس استثارة محلول صبغة Evans blue باستخدام الإعدادات المناسبة، وقارن البيانات المكتسبة بمنحنى قياسي يوضح نفاذ Evans blue عبر HBMEC في نقاط زمنية مختلفة بعد الاستزراع. وبعد التأكد من تكوين الطبقة الخلوية الأحادية، أعد تعليق عينة الخلايا اللمفاوية الدموية الطرفية، أو PBMC، ليكون تركيزها 5 × 10⁶ خلية/مل في وسط RPMI المكمل بـ B27.بعد ذلك، قم بشفط الوسط من الحجرتين السفلية والعلوية للعدد المناسب من إدراجات المزارع الخلوية التي تحتوي على طبقات أحادية متلاحمة من خلايا HBMEC، وأضف 100 microliters من PBMC لكل متبرع إلى إدراجات المزارع الخلوية وإلى بئر واحد من طبق يحتوي على 24 بئراً لكل مجموعة ضابطة في المختبر (in vitro). أضف 600 microliters من RPMI مضافاً إليه B27 إلى الحجرات السفلية لإدراجات المزارع الخلوية و 500 microliters إلى آبار المجموعات الضابطة في المختبر، ثم أعد الأطباق إلى حضانة المزارع الخلوية لمدة ست ساعات. وفي نهاية فترة التحضين، استخدم الملاقط لإزالة إدراجات المزارع الخلوية، مع شطف القواعد بعناية باستخدام 400 microliters من PBS دون لمس الأغشية.بعد ذلك، اخلط جيداً 20 µL من Flow-Count Fluorospheres مع الخلايا في آبار التجربة وآبار الضابطة المختبرية (in vitro control)، وانقل 1 mL من معلقات PBMC الناتجة إلى أنابيب قياس التدفق الخلوي المناسبة. اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي، وأضف الأجسام المضادة المرتبطة بالفلوروكيروم المطلوبة في 100 µL من محلول منظم لقياس التدفق الخلوي إلى كل عينة. وبعد مرور 30 دقيقة في درجة حرارة 4 °C، اغسل الخلايا باستخدام 250 µL من محلول منظم طازج لقياس التدفق الخلوي، وأعد تعليق الرواسب في الحجم المناسب من محلول منظم لقياس التدفق الخلوي من أجل التحليل.بعد الحصول على كافة البيانات، افتح برنامج تحليل قياس التدفق الخلوي المناسب. ولتحليل انتقال المجموعة الفرعية للخلايا القاتلة الطبيعية (NK cell)، ابدأ بتحديد الخلايا اللمفاوية في مخطط قناة التشتت الجانبي مقابل التشتت الأمامي، ثم اعرض الخلايا في مخطط نقطي لـ CD3 مقابل CD56. بعد ذلك، حدد الخلايا القاتلة الطبيعية الإيجابية لـ CD56 والسالبة لـ CD3.للتمييز بين المجموعات الفرعية لخلايا NK المهاجرة، اعرض الخلايا في مخطط CD56 مقابل CD16، وقم بتحديد بوابات الخلايا CD56bright وCD16dim أو السالبة، والخلايا CD56dim وCD16-الموجبة. بعد ذلك، اختر Flow-Count Fluorospheres من مخطط التشتت الأمامي مقابل التشتت الجانبي. ولتحديد عدد الخرزات، اعرض البيانات المختارة في مخطط لقناة تغطي طول موجي للانبعاث بين 525 و700 nanometers مقابل الوقت.أخيرًا، يتم تحديد النسبة المئوية للخلايا NK المهاجرة كنسبة بين العدد الإجمالي للخلايا المهاجرة والعدد الإجمالي للخلايا في مجموعة التحكم المختبرية (in vitro). بعد ثلاثة إلى أربعة أيام من الزرع، عبرت خلايا HBMEC عن جزيء الوصلات المحكمة Zonula occludens-1 ونمت في طبقات أحادية تظهر مقاومة كهربائية عبر البطانية وانخفاضًا في نفاذية صبغة Evans blue. ويؤدي تحفيز الطبقة الأحادية للخلايا البطانية باستخدام interferon gamma و TNF alpha لمدة 24 ساعة قبل إجراء اختبار انتقال خلايا PBMC الكامل إلى زيادة هجرة جميع مجموعات الخلايا اللمفاوية التي تم تحليلها.ومن المثير للاهتمام أن الخلايا القاتلة الطبيعية (NK cells) من النوع CD56bright و CD16dim أو السالبة تظهر قدرة هجرية أعلى من الخلايا القاتلة الطبيعية من النوع CD56dim والموجبة لـ CD16 عبر كل من خلايا HBMEC غير المحفزة وتلك المنشطة بالسيتوكينات. ورغم أن الزيادة النسبية في عملية النفاذ عبر طبقة خلوية أحادية ملتهبة تكون أعلى إجمالاً بالنسبة لخلايا CD56dim، وهو ما يحاكي الملاحظات التي أجريت داخل الجسم الحي بأن الخلايا القاتلة الطبيعية من النوع CD56bright و CD16dim-negative تكون وفيرة في الحيز داخل القرابي. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إتمامها في غضون 10 ساعات.تتيح المعالجة المسبقة لإعدادات الانتقال عبر الخلايا في المختبر باستخدام interferon gamma و TNF alpha دراسة هجرة الخلايا اللمفاوية في ظل الظروف الالتهابية. ويمكن تعديل البروتوكول الخاص بنا من خلال تطبيق قوى القص أو عن طريق الزراعة المشتركة مع خلايا أخرى من الحاجز الدموي الدماغي، مثل الخلايا النجمية، لتوفير نموذج أكثر دقة لانتقال الخلايا اللمفاوية إلى الجهاز العصبي المركزي. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية استقصاء انتقال الخلايا اللمفاوية باستخدام نموذج مختبري للحاجز الدموي الدماغي البشري.

analysis-lymphocyte-extravasation-using-an-vitro-model-human-blood

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

علم المناعة والعدوى

يوضح هذا الفيديو تحقيقا تجريبيا لانتقال الخلايا الليمفاوية عبر نموذج بطانة الحاجز الدموي الدماغي (BBB). يتم إنشاء طبقة أحادية من الخلايا البطانية للأوعية الدموية الدقيقة في الدماغ البشري (HBMECs) في المختبر ، وتضاف خلايا الدم المحيطية أحادية النواة (PBMCs) التي تحتوي على الخلايا الليمفاوية إلى الطبقة الأحادية. ثم يتم تحضين الخلايا للسماح بانتقال الخلايا الليمفاوية ، ويتم قياس الخلايا المهاجرة باستخدام قياس التدفق الخلوي.

دراسة انتقال الخلايا الليمفاوية عبر طبقة أحادية للخلايا البطانية الوعائية الدقيقة

إنشاء نماذج الإنسان من حاجز الدم في الدماغ (BBB) ​​يمكن أن تستفيد من البحث في الظروف الدماغ المرتبطة فشل BBB. نحن هنا وصف تقنية محسنة لإعداد نموذج BBB الاتصال، والذي يسمح coculturing من الخلايا النجمية والخلايا البطانية الإنسان الدماغ على طرفي نقيض من غشاء يسهل اختراقها.

تحسين طريقة لإعداد القائم على الخليوي، الاتصال نموذج الإنسان من حاجز الدم في الدماغ

هنا ، نصف نموذج الفئران في المختبر للحاجز الدموي الدماغي الذي يستخدم التحليل الطيفي لخلايا المعاوقة ، مع التركيز على العواقب على سلامة الخلايا البطانية ونفاذيتها عند التفاعل مع الخلايا التائية المنشطة.

ل<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج من حاجز الدم في الدماغ عن طريق التحليل الطيفي المعاوقة: التركيز على التفاعل خلية تي خلية البطانية

هنا، علينا أن نظهر الأساليب في فيفو التقييم الكمي لخروج الكريات البيض من السذاجة، ملتهبة، والجلد مورين الخبيثة. نقوم بمقارنة وجها لوجه بين نموذجين: فوتوكونفيرسيون التطبيق و في الموقع فيتك عبر الجلد. وعلاوة على ذلك، علينا أن نظهر الأداة المساعدة فوتوكونفيرسيون لتعقب خروج الكريات البيض من الأورام الجلدية.

التحديد الكمي لخروج الكريات البيض عن طريق الأوعية اللمفاوية من الجلد مورين والأورام

نقدم اختبار الفلورة لإثبات أن لوسيفر الأصفر (LY) هو علامة قوية لتحديد نفاذية شبه الخلايا الظاهرة من الخلايا أحادية hCMEC /D3، وهو نموذج في المختبر من حاجز الدم والدماغ البشري. استخدمنا هذا الفحص لتحديد حركية تشكيل أحادي الطبقات في خلايا hCMEC/D3 المستزرعة.

لوسيفر الأصفر - علامة نفاذية شبه خلوية قوية في نموذج خلية من حاجز الدم في الدماغ البشري

نقدم هنا، بروتوكولات للتحقيق في الأضرار بوحدة neurovascular خلال النخاع الذاتية التجريبية المجراة. ونحن على وجه التحديد معالجة كيفية تحديد نفاذية حاجز الدم في الدماغ والنشاط جيلاتيناسي المعنية بالهجرة الكريات البيض عبر ليميتانس إطلاق.

تصور ضعف الحواجز بطانية والدبقيه نيوروفاسكولار وحدة خلال النخاع الذاتية التجريبية في فيفو

في هذا البروتوكول ، يتم وضع الخلايا الليمفاوية في الغرفة العليا لنظام الهجرة ، مفصولة عن الغرفة السفلية بواسطة غشاء مسامي. يضاف Chemokine إلى الغرفة السفلى، مما يحفز الهجرة النشطة على طول التدرج chemokine. بعد 48 ساعة، يتم حساب الخلايا الليمفاوية في كلتا الغرفتين لتكميم الهجرة.

تقييم هجرة الخلايا الليمفاوية في نظام الهجرة فيفو السابقين

تقدم هذه المخطوطة بروتوكولاً للحث على التهاب الدماغ المناعي الذاتي التجريبي النشط (EAE) في الفئران. كما يتم تقديم طريقة لعزل وتوصيف الخلايا الليمفاوية المتسللة في الجهاز العصبي المركزي (CNS) لإظهار كيفية مشاركة الخلايا الليمفاوية في تطور مرض المناعة الذاتية للجهاز العصبي المركزي.

تحليل تدفق Cytometric لتسلل الخلايا اللمفاوية في الجهاز العصبي المركزي أثناء التهاب الدماغ المناعي الذاتي التجريبي

هنا ، نصف بروتوكولا ، طريقة زراعة الخلايا البطانية الممتدة (EECM) ، والتي تسمح بتمايز الخلايا الجذعية متعددة القدرات إلى خلايا تشبه الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة في الدماغ (BMEC). تظهر هذه الخلايا تعبيرا جزيئيا عن التصاق الخلايا البطانية ، وبالتالي فهي نموذج حاجز دموي دماغي بشري مناسب لدراسة تفاعلات الخلايا المناعية في المختبر.

تمايز الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة بشريا إلى خلايا شبيهة بالخلايا البطانية الوعائية الدقيقة في الدماغ ذات النمط الظاهري المناعي الناضج

يوفر هذا التقرير بروتوكولات للتجميع وزراعة الخلايا والمقايسات على منصة μSiM لبناء نماذج الحاجز الدموي الدماغي.

استخدام منصة الأنسجة الحاجزة MicroSiM (μSiM) لنمذجة الحاجز الدموي الدماغي

تم تطوير طريقة لتصور تسرب الصبغة بسبب انهيار الحاجز الدموي الدماغي (BBB) عن طريق إعطاء صبغتين فلوريتين للفئران في نقاط زمنية مختلفة. سهل استخدام الجلسرين كمادة حاصلة بالتبريد الكيمياء المناعية على نفس العينة.

تقييم انهيار الحاجز الدموي الدماغي في نموذج فأر لإصابات الدماغ الرضحية الخفيفة

اكتشف تحليل انتقال الخلايا الليمفاوية عبر حاجز الدم في الدماغ البشري في المختبر. تتيح هذه الطريقة دراسة آليات الالتهابات العصبية وتطوير استراتيجيات علاجية جديدة بدقة عالية.

تحليل الخلايا الليمفاوية التسرب باستخدام

استكشف المزيد من الفيديوهات