القصبات الغسل من الفئران الرئتين لتحليل التهاب تسلل خلية

الهدف العام من هذا الإجراء هو حصاد المحتويات الخلوية واللاخلوية لتجويف الرئة عن طريق غسل الشعب الهوائية لتحليلات خارج الجسم الحي ولتقييم حالة المرض المستمرة للحيوان. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال المناعة التنفسية حول العدوى والآليات المناعية الناجمة عن الالتهاب من خلال القياس الكمي للاستجابات الخلوية والخلطية الفطرية في الرئة. تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية في أنها بسيطة وفعالة وقابلة للتكرار بدرجة كبيرة ولا توجد حاجة لمعدات أو أدوات خاصة.

قبل البدء في الإجراء ، قم بإنشاء قسطرة عن طريق إدخال إبرة قياس 23 في قطعة 0.5 سم من البلاستيك الشفاف البولي إيثيلين قياس 21 ووضع في وضع ضعيف. قم بتأمين أطراف الفأر وتطهير الرقبة بنسبة 70٪ من الإيثانول. ثم استخدم مشرطا لعمل شق جلدي بالقرب من القصبة الهوائية.

افتح الجلد لكشف الغدد اللعابية واستخدم الملقط لفصل الغدد والكشف عن العضلة اللامية القصية. استخدم الملقط لشق العضلة حول القصبة الهوائية. عندما يكون مرئيا ، استخدم الملقط لخيط خياطة قطنية تحت أنسجة القصبة الهوائية.

بعد ذلك ، استخدم إبرة قياس 26 لثقب منتصف القصبة الهوائية بعناية بين حلقتين من الغضروف وإدخال القسطرة المعدة مسبقا حوالي 0.5 سم في تجويف القصبة الهوائية. قم بتثبيت القسطرة بالخياطة. بعد ذلك ، قم بتحميل حقنة سعة مليلتر واحد بمليلتر واحد من محلول الملح المعقم المتوازن المكمل ب 100 ميكرومولار EDTA.

قم بتوصيل المحقنة المحملة بالقسطرة وحقن الملح المتوازن ومحلول EDTA برفق في الرئة. عندما يتم حقن كل المحلول الملحي ، قم بشفط المحلول برفق أثناء تدليك الصدر. من المهم جدا أن تكون لطيفا عند حقن السائل الصلب واستعادته لزيادة استرجاع سائل BAL وتقليل قوى التقشير.

إذا مر السائل الصلب عبر الأنف ، فأعد تأمين الخيط على طول القسطرة. عندما يتم جمع كل الشفطة ، انقل السائل إلى أنبوب سعة 15 مليلتر على الجليد وكرر الغسيل مرتين أخريين. بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال هذه التقنية في سبع دقائق إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

بعد مجموعة غسل القصبات الهوائية الثالثة ، قم بالطرد المركزي للشفط المجمع وتخزين المادة الطافية عند سالب 80 درجة مئوية. أعد تعليق الحبيبات في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتحلل ACC. بعد ما لا يزيد عن دقيقتين في درجة حرارة الغرفة ، قم بتخفيف المخزن المؤقت للتحلل بمليلتر واحد من PBS البارد وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي.

أعد تعليق الحبيبات في الحجم المناسب من PBS لعدد العينات المراد تحليلها وتقسيم الخلايا إلى العدد المناسب من الآبار من 96 لوحة بئر للتحليل. اجمع الخلايا عن طريق طرد مركزي آخر وأعد تعليق الكريات في 50 ميكرولتر من FC Block و PBS. بعد 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، أضف 50 ميكرولترا من كوكتيل الأجسام المضادة المناسب محل الأهمية لكل بئر واحتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية محمية من الضوء.

في نهاية الحضانة ، قم بالطرد المركزي للوحة وتخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الكريات إلى حجم نهائي قدره 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفاكس لكل بئر لتحليل قياس التدفق الخلوي. باستخدام استراتيجية البوابات القائمة على التعبير التفاضلي للمستضدات على أسطح مجموعات مختلفة من خلايا غسل القصبات الهوائية ، من الممكن تحديد مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا المناعية. الخلايا والمفردات مسورة وفقا لخصائص التشتت الأمامية والجانبية.

يتم بوابات الخلايا السالبة للصبغة الحية / الميتة ، متبوعة بتحديد خلايا Cd11c High و Cd11c المنخفضة. في Cd11c High السكان ، يمكن تحديد الضامة والخلايا المتغصنة بناء على تعبير معقد التوافق النسيجي الكبير الثاني و SinglecF على التوالي. في Cd11c منخفض السكان ، يمكن تحديد الخلايا التائية والخلايا البائية بناء على تعبير CD3 / CD19 و MHC-II.

في الخلايا المتبقية ، يمكن التعرف على الحمضات والعدلات من خلال تعبير علامة Cd11b أو Ly-6G على التوالي. يمكن أيضا إضافة عد الخرز لتحديد أعداد الخلايا المطلقة لمجموعات الخلايا المختلفة من خلال مقارنة نسبة أحداث الخرزة إلى الخلايا ، على سبيل المثال ، في الساذجة مقابل المحفزة LPS. بعد حصاد سائل BAL ، يمكن إجراء تقنيات أخرى مثل مصفوفة حبة السيتوكين المناعية ELISA للإجابة على أسئلة إضافية حول المحتوى اللاخلوي لسائل BAL.

بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال المناعة لاستكشاف المحتوى الخلوي واللاخلوي لتجويف الرئة للفئران. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية أداء BAL بكفاءة وتكرار.