Name: القصبات الغسل من الفئران الرئتين لتحليل التهاب تسلل خلية (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-04T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: تعلم تقنية القصبات الغسل لعزل الخلايا المناعية من رئات الفئران. تُمكّن هذه الطريقة البسيطة والفعالة الباحثين من تقييم الاستجابات المناعية التنفسية وآليات الالتهاب بدقة عالية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

لف هو مساعد باحث في قسم البيولوجيا الجزيئية الطبية الحيوية من جامعة غنت. ويدعم إرج من قبل ونيفاكفلو، منحة رقم 607690. ويدعم كر من قبل مشروع إيك-FP7 فلونيفاك.

<ol><li>Stankunas, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+protein+alleles+using+knockin+mice+and+a+chemical+inducer+of+dimerization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Conditional protein alleles using knockin mice and a chemical inducer of dimerization.</a> Mol Cell. 12 (6), 1615-1624 (2003).</li>
<li>Hunninghake, G. W., Gadek, J. E., Kawanami, O., Ferrans, V. J., Crystal, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+and+immune+processes+in+the+human+lung+in+health+and+disease%3A+evaluation+by+bronchoalveolar+lavage%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Inflammatory and immune processes in the human lung in health and disease: evaluation by bronchoalveolar lavage.</a> Am J Pathol. 97 (1), 149-206 (1979).</li>
<li>Gee, J. B., Fick, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bronchoalveolar+lavage%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Bronchoalveolar lavage.</a> Thorax. 35 (1), 1-8 (1980).</li>
<li>Tornling, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronic+acid+in+bronchoalveolar+lavage+in+rats+exposed+to+quartz%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Ind+Med%22%5BJournal%5D)">Hyaluronic acid in bronchoalveolar lavage in rats exposed to quartz.</a> Br J Ind Med. 44 (7), 443-445 (1987).</li>
<li>Henderson, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+bronchoalveolar+lavage+to+detect+respiratory+tract+toxicity+of+inhaled+material%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Toxicol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Use of bronchoalveolar lavage to detect respiratory tract toxicity of inhaled material.</a> Exp Toxicol Pathol. 57, Suppl 1. 155-159 (2005).</li>
<li>Morris, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+analysis+of+the+lung+microbiota+of+cynomolgous+macaques+during+long-term+SHIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">Longitudinal analysis of the lung microbiota of cynomolgous macaques during long-term SHIV infection.</a> Microbiome. 4 (1), 38(2016).</li>
<li>Naessens, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GM-CSF+treatment+prevents+respiratory+syncytial+virus-induced+pulmonary+exacerbation+responses+in+postallergic+mice+by+stimulating+alveolar+macrophage+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">GM-CSF treatment prevents respiratory syncytial virus-induced pulmonary exacerbation responses in postallergic mice by stimulating alveolar macrophage maturation.</a> J Allergy Clin Immunol. 137 (3), 700-709 (2016).</li>
<li>Chockalingam, A., Duraiswamy, R., Jagadeesan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bronchoalveolar+lavage+cellular+analyses+in+conjunction+with+high-resolution+computed+tomography+imaging+as+a+diagnostic+intervention+for+patients+with+suspected+interstitial+lung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lung+India%22%5BJournal%5D)">Bronchoalveolar lavage cellular analyses in conjunction with high-resolution computed tomography imaging as a diagnostic intervention for patients with suspected interstitial lung disease.</a> Lung India. 33 (3), 287-291 (2016).</li>
<li>Crystal, R. G., Reynolds, H. Y., Kalica, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bronchoalveolar+lavage.+The+report+of+an+international+conference%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">Bronchoalveolar lavage. The report of an international conference.</a> Chest. 90 (1), 122-131 (1986).</li>
<li>Baughman, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+uncertainties+of+bronchoalveolar+lavage%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Respir+J%22%5BJournal%5D)">The uncertainties of bronchoalveolar lavage.</a> Eur Respir J. 10 (9), 1940-1942 (1997).</li>
<li>Singletary, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+a+common+BAL+technique+to+enhance+sample+diagnostic+value%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Assoc+Lab+Anim+Sci%22%5BJournal%5D)">Modification of a common BAL technique to enhance sample diagnostic value.</a> J Am Assoc Lab Anim Sci. 47 (5), 47-51 (2008).</li>
<li>Angus, D. W., Baker, J. A., Mason, R., Martin, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+influence+of+CO2%2C+as+an+agent+for+euthanasia%2C+on+the+pharmacokinetics+of+basic+compounds+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Metab+Dispos%22%5BJournal%5D)">The potential influence of CO2, as an agent for euthanasia, on the pharmacokinetics of basic compounds in rodents.</a> Drug Metab Dispos. 36 (2), 375-379 (2008).</li>
<li>Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+protocols+for+surface+and+intracellular+antigen+analyses+of+neural+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types.</a> J Vis Exp. (94), (2014).</li>
<li>Inglis, H., Norris, P., Danesh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+for+the+analysis+of+extracellular+vesicles+using+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Techniques for the analysis of extracellular vesicles using flow cytometry.</a> J Vis Exp. (97), (2015).</li>
<li>Rubio-Navarro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+Characterization+of+Macrophages+from+Rat+Kidney+by+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry.</a> J Vis Exp. (116), (2016).</li>
<li>Butcher, M. J., Herre, M., Ley, K., Galkina, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+analysis+of+immune+cells+within+murine+aortas%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry analysis of immune cells within murine aortas.</a> J Vis Exp. (53), (2011).</li>
<li>Noto, A., Ngauv, P., Trautmann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-based+flow+cytometry+assay+to+measure+cytotoxic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Cell-based flow cytometry assay to measure cytotoxic activity.</a> J Vis Exp. (82), e51105(2013).</li>
<li>Adan, A., Alizada, G., Kiraz, Y., Baran, Y., Nalbant, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry%3A+basic+principles+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry: basic principles and applications.</a> Crit Rev Biotechnol. , 1-14 (2016).</li>
<li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5061/the-elisa-method">The ELISA method.</a> J Vis Exp. , (2016).</li>
<li>Gallagher, S., Chakavarti, D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19066547">Immunoblot analysis.</a> J Vis Exp. (16), (2008).</li>
<li>Wunderlich, M. L., Dodge, M. E., Dhawan, R. K., Shek, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+fluorometric+immunoassay+testing+methodology+and+troubleshooting%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Multiplexed fluorometric immunoassay testing methodology and troubleshooting.</a> J Vis Exp. (58), (2011).</li>
<li>Song, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+of+bronchoalveolar+lavage+method+based+on+suction+frequency+number+and+lavage+fraction+number+using+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Res%22%5BJournal%5D)">Standardization of bronchoalveolar lavage method based on suction frequency number and lavage fraction number using rats.</a> Toxicol Res. 26 (3), 203-208 (2010).</li>
<li>Seliger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+high-precision+flow+cytometry+based+technique+for+total+white+blood+cell+counting+in+chickens%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Immunol+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">A rapid high-precision flow cytometry based technique for total white blood cell counting in chickens.</a> Vet Immunol Immunopathol. 145 (1-2), 86-99 (2012).</li>
<li>Daniele, R. P., Elias, J. A., Epstein, P. E., Rossman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bronchoalveolar+lavage%3A+role+in+the+pathogenesis%2C+diagnosis%2C+and+management+of+interstitial+lung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Intern+Med%22%5BJournal%5D)">Bronchoalveolar lavage: role in the pathogenesis, diagnosis, and management of interstitial lung disease.</a> Ann Intern Med. 102 (1), 93-108 (1985).</li>
<li>Delayre-Orthez, C., Becker, J., de Blay, F., Frossard, N., Pons, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposure+to+endotoxins+during+sensitization+prevents+further+endotoxin-induced+exacerbation+of+airway+inflammation+in+a+mouse+model+of+allergic+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Arch+Allergy+Immunol%22%5BJournal%5D)">Exposure to endotoxins during sensitization prevents further endotoxin-induced exacerbation of airway inflammation in a mouse model of allergic asthma.</a> Int Arch Allergy Immunol. 138 (4), 298-304 (2005).</li>
<li>Delayre-Orthez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PPARalpha+downregulates+airway+inflammation+induced+by+lipopolysaccharide+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Res%22%5BJournal%5D)">PPARalpha downregulates airway inflammation induced by lipopolysaccharide in the mouse.</a> Respir Res. 6, 91(2005).</li>
<li>Delayre-Orthez, C., de Blay, F., Frossard, N., Pons, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dose-dependent+effects+of+endotoxins+on+allergen+sensitization+and+challenge+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Allergy%22%5BJournal%5D)">Dose-dependent effects of endotoxins on allergen sensitization and challenge in the mouse.</a> Clin Exp Allergy. 34 (11), 1789-1795 (2004).</li>
<li>Hachet-Haas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+neutralizing+molecules+to+inhibit+actions+of+the+chemokine+CXCL12%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Small neutralizing molecules to inhibit actions of the chemokine CXCL12.</a> J Biol Chem. 283 (34), 23189-23199 (2008).</li>
<li>Ble, F. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+lung+S1P%281%29+receptor+reduces+allergen-induced+plasma+leakage+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Activation of the lung S1P(1) receptor reduces allergen-induced plasma leakage in mice.</a> Br J Pharmacol. 158 (5), 1295-1301 (2009).</li>
<li>Ble, F. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allergen-induced+lung+inflammation+in+actively+sensitized+mice+assessed+with+MR+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Radiology%22%5BJournal%5D)">Allergen-induced lung inflammation in actively sensitized mice assessed with MR imaging.</a> Radiology. 248 (3), 834-843 (2008).</li>
<li>Reber, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dissociated+glucocorticoid+receptor+modulator+reduces+airway+hyperresponsiveness+and+inflammation+in+a+mouse+model+of+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">A dissociated glucocorticoid receptor modulator reduces airway hyperresponsiveness and inflammation in a mouse model of asthma.</a> J Immunol. 188 (7), 3478-3487 (2012).</li>
<li>Drent, M., Cobben, N. A., Henderson, R. F., Wouters, E. F., van Dieijen-Visser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Usefulness+of+lactate+dehydrogenase+and+its+isoenzymes+as+indicators+of+lung+damage+or+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Respir+J%22%5BJournal%5D)">Usefulness of lactate dehydrogenase and its isoenzymes as indicators of lung damage or inflammation.</a> Eur Respir J. 9 (8), 1736-1742 (1996).</li>
<li>Henderson, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+bronchoalveolar+lavage+to+detect+lung+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">Use of bronchoalveolar lavage to detect lung damage.</a> Environ Health Perspect. 56, 115-129 (1984).</li>
<li>Forget, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+adherent+cell+perifusion+technique+to+study+the+overall+and+sequential+response+of+rat+alveolar+macrophages+to+toxic+substances%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">An adherent cell perifusion technique to study the overall and sequential response of rat alveolar macrophages to toxic substances.</a> Environ Health Perspect. 51, 131-140 (1983).</li>
<li>Sung, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+from+welding-fume-exposure-induced+lung+fibrosis+and+pulmonary+function+changes+in+sprague+dawley+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">Recovery from welding-fume-exposure-induced lung fibrosis and pulmonary function changes in sprague dawley rats.</a> Toxicol Sci. 82 (2), 608-613 (2004).</li>
<li>Majetschak, M., Sorell, L. T., Patricelli, T., Seitz, D. H., Knoferl, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+possible+role+of+proteasomes+in+the+bronchoalveolar+space+of+the+injured+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Res%22%5BJournal%5D)">Detection and possible role of proteasomes in the bronchoalveolar space of the injured lung.</a> Physiol Res. 58 (3), 363-372 (2009).</li>
<li>Rehn, B., Bruch, J., Zou, T., Hobusch, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+rat+alveolar+macrophages+by+bronchoalveolar+lavage+under+normal+and+activated+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">Recovery of rat alveolar macrophages by bronchoalveolar lavage under normal and activated conditions.</a> Environ Health Perspect. 97, 11-16 (1992).</li>
<li>Kelly, C. A., Ward, C., Stenton, S. C., Hendrick, D. J., Walters, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+pulmonary+macrophage+and+neutrophil+function+in+sequential+bronchoalveolar+lavage+aspirates+in+sarcoidosis%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Assessment of pulmonary macrophage and neutrophil function in sequential bronchoalveolar lavage aspirates in sarcoidosis.</a> Thorax. 43 (10), 787-791 (1988).</li>
<li>Eklund, A., Tornling, G., Blaschke, E., Curstedt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+components+in+bronchoalveolar+lavage+fluid+in+quartz+exposed+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Ind+Med%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix components in bronchoalveolar lavage fluid in quartz exposed rats.</a> Br J Ind Med. 48 (11), 776-782 (1991).</li>
<li>Olsen, G. N., Harris, J. O., Castle, J. R., Waldman, R. H., Karmgard, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-1-antitrypsin+content+in+the+serum%2C+alveolar+macrophages%2C+and+alveolar+lavage+fluid+of+smoking+and+nonsmoking+normal+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Alpha-1-antitrypsin content in the serum, alveolar macrophages, and alveolar lavage fluid of smoking and nonsmoking normal subjects.</a> J Clin Invest. 55 (2), 427-430 (1975).</li>
</ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

بال هو تقنية مفيدة للحصول على المعلومات الخلوية والبيوكيميائية ردا على العدوى أو المخدرات. في البداية، تم استخدام بال لإدارة إنتاج المخاط المفرط في المرضى الذين يعانون من سمية الفوسجين 3 . في الوقت الحاضر، يتم استخدام هذه التقنية في البشر للتحقيق المرضية الرئة، والتشخيص، والعلاجية من الأمراض 3 ، 24 . في الحيوانات المختبرية، ويشيع استخدام بال لمراقبة الاستجابات الالتهابية، وآليات المناعة، وعمليات الأمراض المعدية التي تحدث في الشعب الهوائية الرئوية 1 ، 2 . لدراسة النمط الخلوي الالتهابي في نماذج أمراض الجهاز التنفسي، يجب أن يتبع بال من قبل العد المطلق والخلايا التفاضلية. بالإضافة إلى رقم الخلية المطلقة، أرقام الخلايا النسبية هي أيضا ذات أهمية. على سبيل المثال، تظهر نماذج الإصلاح والسرطان vريها الصغيرة ولا BAL زيادة عدد خلايا. في هذا النموذج، وتقييم التكوين الخلوي هو مفيد. باستخدام تلطيخ الخلايا جنبا إلى جنب مع المجهر الضوئي، وأنواع مختلفة من الخلايا، مثل الحمضات، العدلات، الضامة، والخلايا الليمفاوية، ويمكن التعرف على أساس التشكل 25 و 26 و 27 و 28 و 29 و 30. التدفق الخلوي يمكن استخدامها لتقييم محددة، مثل التعرف على مختلف الظواهر T-خلية 7، 31. بالإضافة إلى التعرف على مختلف السكان الخلية التسلل، وتكوين غير الخلوية من الرئة يمكن التحقيق باستخدام BAL. يتم تنفيذ أساليب مثل ELISA، مناعية، مجموعة خلوى حبة، المناعية، والكمي تفاعل البلمرة المتسلسل على BAL السائل لتحديد السيتوكينات والنموعوامل ومكونات التهابات أخرى. لتحديد الضرر الرئة، ومجموع مستويات البروتين ونازعة اكتات في السائل BAL يمكن أيضا قياس 32 و 33. مع تطور أدوات جديدة للتشخيص، فإن التوصيف الجيني والبروتين من المكونات BAL يكون ممكنا في المستقبل القريب. والجمع بين توسيع قدرات الحسابية والتكنولوجيات التعبير الجيني الإنتاجية العالية تجعل من الممكن تحديد ملامح التعبير الجيني محددة لمختلف الحالات المرضية. ويمكن تنفيذ هذه التقنيات على BAL السائل توفير الجينات والبروتينات أنماط لتحديد جزيئات مهمة المشاركة في مراحل مختلفة من أمراض الرئة. القيد الرئيسي للبيانات التي تم الحصول عليها من BAL السائل هو عدم وجود مقارنة بين مختلف التجارب البحثية 3 و 9. هناك درجة عالية منالتباين في تقنية غسل والتجهيز اللاحقة من السوائل بال. لتكون قادرة على مقارنة كل محاكمة بال، فمن الضروري لتوحيد نوع السائل غسل التي يتم غرس، وموقع تقطير، والجزء الذي يتم تحليلها لتكوين الخلوية وغير الخلوية. هناك اختلافات كبيرة في عدد الكسور غسل بين التجارب المختلفة، وتتراوح من واحد إلى 14 مرات 34 ، 35 ، 36 . هذا الاختلاف قد يكون له تأثير على إجمالي عدد الخلايا في الرئتين. من المهم أن تعرف أي جزء السوائل بال يحتوي على غالبية الخلايا. سونغ وآخرون. أظهرت أن ما يقرب من 70٪ من إجمالي عدد الخلايا تم استرجاعها في جزء واحد إلى ثلاثة 22 . ومع ذلك، أشارت تقارير أخرى أن الغسل الثاني يحتوي على خلايا أكثر من الخلايا الأولى 37 ، 38 </sup&gt;. يمكننا أن نستنتج من هذه الدراسات أن غسل مع جزء واحد فقط لا يمثل الرئة بأكملها، مما يؤدي إلى سوء تفسير النتائج. تكوين noncellular من السائل BAL يحتوي على معلومات قيمة عن الحالة الصحية للرئة 33 و 39 و 40. الاختلافات في التخفيف من السوائل BAL تسهم في الاختلاف في تقدير حجم الكسر للذوبان، وبالتالي، إلى الاختلافات في النتائج بين التجارب. أغنية وآخرون. مقارنة البروتين ومستويات اللاكتات نازعة من كل جزء غسيل وخلص إلى أن أول جزء غسيل يرد مرتين إلى ثلاث مرات أكثر من جزء الثاني. لاسترداد عينة تمثيلية BAL للتحليل، وبعض الاعتبارات التقنية حاسمة. واحد منهم هو لأداء التخدير المناسب. من المهم جدا للتحقق من المرجع القدميكس من الماوس لضمان التخدير الطرفي. هذا ليس مهما فقط لأسباب أخلاقية، ولكن أيضا لأنه من الصعب وضع والاحتفاظ القسطرة في الموضع الصحيح إذا لم يتم تخدير الماوس بشكل صحيح. وهناك اعتبار الفني الثاني المهم هو موقف القسطرة في القصبة الهوائية. عندما يتم إدخال القسطرة عميق جدا، يمكن أن تلحق الضرر هيكل الرئة. يجب على الطرف البعيد من القسطرة لا تصل إلى الرئتين أثناء إجراء BAL. وينبغي أيضا أن يستقر القسطرة، وتعادل قبالة مع خيط القطن. ولو لم يستقر القسطرة، قد تدفق محلول ملحي حقن صعودا إلى تجويف الأنف بدلا من أسفل إلى الرئتين. خلال الحقن وتطلع محلول ملحي، من المهم عقد القسطرة ثابتة. البيانات التي تم الحصول عليها من السوائل BAL يجب أن يمثل الرئة الفئران كلها. ولذلك، من المهم أن غرس حجم كاف من العازلة المالحة (أي3 مل، مقسمة إلى 3 aliquots من 1 مل لكل منهما). ليست هناك علاقة خطية بين العائد الخلية والعائد السوائل بال. ومن المهم لجمع الحل بلطف بينما تدليك الصدر من الفأرة. إذا قوى القص قوية جدا، وقدرتها على البقاء، وظيفة، وهيكل الخلايا داخل السائل الهوائية وBAL يجوز المساس بها. إذا كان السائل يستنشق غير مرئي في المحقنة، نقل بعناية القسطرة أعمق أو أعلى في القصبة الهوائية. وينبغي إيلاء إشعار خاص لجوانب محددة من معالجة BAL والتحليل. وهذا تعظيم المعلومات المدورة من العينات BAL. بعد BAL، كانت الخلايا في المياه المالحة المتوسطة الفقيرة بالمغذيات. ولذا فمن المهم جدا لمعالجة العينات في غضون 1 ساعة بعد أخذ العينات BAL. إذا التخزين لفترات طويلة أمر ضروري، لا بد من استخدام وسيلة تستكمل المواد الغذائية. للحفاظ على بقاء الخلية، وتجنب الأنابيب التي تعزز التزام الخلية إلى السطح. تجنب مntrifugation من الايقاف الخلية بسرعات التي من المحتمل أن تعرض سلامة الخلوية أو لمنع إعادة تعليق موحد للخلايا BAL استردادها. يجب طرد BAL السائل تحتوي على خلايا في 400 x ج و 4 درجة مئوية لمدة 7 دقائق. من المهم أن نضع في اعتبارنا أن تعليق خلية ينبغي أن تعقد في 4 درجات مئوية أثناء المعالجة.

تواجه الشعب الهوائية العديد من الشتائم، والتي يمكن أن تؤدي إلى التهاب، غزو الممرض، أو التحول الخبيث. الخلايا الظهارية التي تشكل خط التجويف الرئة تشكل واحدة من الحواجز الرئيسية للجسم الثدييات. جنبا إلى جنب مع البلاعم السنخية، فإنها تمنع التهديدات البيئية من الدخول إلى النظام النظامي عبر الشعب الهوائية. ومن أمثلة هذه التهديدات المواد الكيميائية العضوية وغير العضوية، والبكتيريا، والفيروسات. وبالمثل، يمكن تصميم التحصينات أو التدخلات العلاجية المحددة لاستهداف الرئتين. في جميع هذه الحالات، تحليل مفصل للاستجابة أثار مهم لفهم، التدخل، أو منع العمليات البيولوجية التي تحدث داخل الجهاز التنفسي. غسل القصبات (بال) هو وسيلة لا تقدر بثمن لتحليل هذه الردود، حيث أن العينات الناتجة تحتوي على معلومات هامة حول الاستجابات الالتهابية، وآليات المناعة، وتطور الأمراض المعديةالتي يمكن أن تحدث في الشعب الهوائية الرئوية 1 و 2. باستخدام BAL، فمن الممكن لدراسة الخلايا التسلل. وهذا يتناقض مع الرئتين هضمها، التي تعطي &quot;أقذر&quot; سكان الخلية، مع العديد من الخلايا الميتة ولزجة. يتم تنفيذ BAL عن طريق إدخال محلول ملحي في القصيبات الطرفية وبعد ذلك يتعافى هذا الحل. ويمكن بعد ذلك حل استردادها أن تستخدم لتحديد وتحليل ظاهريا الرئة المقيمين وتسلل الخلايا الالتهابية. في كثير من الأحيان يتم تطبيق هذا الأسلوب لدراسة تدفق الخلوي في نماذج المرض في الشعب الهوائية، مثل الربو ومرض الرئة الانسدادي المزمن (COPD)، ونماذج الأمراض المعدية. وبصرف النظر عن تكوين الخلايا، وينعكس التركيب الجزيئي في الشعب الهوائية الرئوية أيضا في السائل BAL. لتحليل هذا، انزيم مرتبط المناعي فحص (ELISA)، مناعية، والتحليل في وقت واحد من السيتوكينات متعددة من قبل مجموعة خلوى حبة يمكن أن يكونأجريت لتقييم وجود السيتوكينات و تشيموكينس. بال هو طريقة راسخة لدراسة تدفق الخلايا الالتهابية في نماذج التهابات أمراض الجهاز التنفسي الحيوانية. مراقبة تدفق الخلوي تغير (على سبيل المثال، زيادة مستويات الخلايا الليمفاوية، الحمضات، أو العدلات) يمكن أن يؤدي إلى رؤى أفضل في المرض ويمكن أن يكون معلما موضوعيا لتقييم أداء التدخل العلاجي. يتطلب تفسير دقيقة وقابلة للتكرار للتحليل الخلوي بال أن يتم تنفيذ بال بشكل صحيح وأنه يتم التعامل مع السوائل التي تم جمعها ومعالجتها بشكل صحيح. مصطلح &quot;غسل الشعب الهوائية&quot; قدم أكثر من ثمانين عاما من قبل ستيت 3 . في عام 1961، حصل ميرفيك الضامة السنخية من السائل غسل أرنب الرئتين 3 . بال هو الآن طريقة شائعة الاستخدام لتحليل ورصد الرئتين في نموذج الفأر، ولكنإعادة لا يزال لا يوجد تقرير عن إجراء بال موحدة في الأدب العلمي 4 ، 5 . وعلاوة على ذلك، هناك على الأرجح العديد من الطرق لأداء بال كما أن هناك مختبرات البحوث باستخدام تقنية 3 ، 6 ، 7 ، 8 ، 9 ، 10 ، 11 . من المهم أن البيانات التي تم الحصول عليها من بال تمثل الرئة الفئران كله، وليس فقط جزءا من الرئة. هذا النوع من التباين يعقد تفسير ومقارنة النتائج بين التجارب المختلفة. هنا، وصفت الإجراء الأساسي وغير مكلفة، وقابلة للتكرار بال الذي يسمح جمع جزء الخلوية وقابل للذوبان الموجودة في تجويف مجرى الهواء من الفأرة. باختصار، يتم وضع قسطرة في القصبة الهوائية المكشوفة oفا تخدير الماوس مؤقتا. يتم توصيل المحاقن إلى القسطرة، ويتم إدخال محلول ملحي مخزنة تحتوي على حمض إيثيلينديامينتيتراسيتيك (إدتا) في الرئتين. يتم أخذ عينات تجويف الرئة عن طريق التنظيف المتكرر اللطيف من محلول ملحي باستخدام المكبس. الضغط السلبي المطبق خلال هذه الخطوة هو الحد الأدنى لمنع انهيار مجرى الهواء. بعد جمع، يجب أن تتم معالجتها بال مزيد من التعداد وتحديد الخلايا عن طريق التدفق الخلوي.

<table><tbody><tr><td>محلول الملح المتوازن هانكس (HBSS)</td><td>ثيرمو فيشر العلمي</td><td>14175-129</td><td></td></tr><tr><td>حمض الخليك إيثيلين ديامين تترا (EDTA)</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>E6511</td><td>مزعج</td></tr><tr><td>23 جم × 1 1/4 إبرة</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4710006030</td><td>الحجم: 0.60 × 30 مم</td></tr><tr><td>26 جم × 1/2 إبرة</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4710004512</td><td>الحجم: 0.45 × 12 مم</td></tr><tr><td>أنابيب بلاستيكية</td><td>BD التكنولوجيا الطبية</td><td>427411</td><td>أنابيب البولي إيثيلين ، معرف 0.58 مم (0.023 بوصة) OD 0.965 مم (0.38 بوصة) 30.5 م (100 بوصة)</td></tr> <tr><td>بنتوباربيتال الصوديوم</td><td>Kela NV</td><td>514</td><td></td></tr><tr><td>محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) Lonza</td><td></td> <td>BE17-516F</td><td>PBS بدون Ca2 + Mg2 + أو أحمر الفينول ؛</td></tr><tr><td>محاقن معقمة 1 مل</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>5010.200V0</td><td>ملقط غير حراري وغير سام</td></tr><tr><td></td><td>أدوات العلوم الدقيقة GmbH&nbsp;</td><td>91197-00</td><td></td></tr><tr><td>مقص جراحي</td><td>أدوات العلوم الدقيقة GmbH&nbsp;</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>أنبوب الطرد المركزي 50 مل</td><td>TH. Geyer</td><td>7696705</td> خالي من أنبوب الطرد المركزي <td>Rnase / Dnase / endotoxin</td></tr><tr><td>15 مل</td><td>TH. </td><td>Geyer 7696702</td> خال من أنبوب الطرد المركزي <td>الدقيق Rnase / Dnase / endotoxin</td></tr><tr><td>1.5 مل</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>0030 120.094</td> جهاز طرد مركزي <td>دقيق من مادة البولي بروبيلين</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5415R</td><td></td></tr> أجهزة <tr><td>الطرد المركزي</td><td>الحرارية فيشر العلمية</td><td>75004030</td><td></td></tr><tr><td>الأمونيوم كلوريد والبوتاسيوم (ACK) محلول عازل</td><td>Lonza</td><td>10-548E</td><td>معقم</td></tr><tr><td>حية / ميتة - efluor 506</td><td>ebioscience</td><td>65-0866-18 &nbsp;</td><td>صبغة الجدوى القابلة للإصلاح</td></tr><tr><td>CD11c-PE-cy7</td><td>eBiosciences</td><td>25-0114-81</td><td></td></tr><tr><td>SiglecF-PE</td><td>BD Pharmingen&nbsp;</td><td>552126&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MHCII-APCefluor780</td><td>Biolegend</td><td>107628&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CD3-PE-cy5</td><td>VWR</td><td>55-0031-U100&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CD19-PE-cy5</td><td>eBiosciences</td><td>15-0193-83&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-V450</td><td>BD Pharmingen&nbsp;</td><td>560455&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ly6G-AF700</td><td>Biolegend</td><td>127621</td><td></td></tr><tr><td>العد المطلق الخرز</td><td>Life Technologies Europe B.V.&nbsp;</td><td>C36950</td><td></td></tr><tr><td>المضادة CD16 / CD32</td><td>BD Pharmingen</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>96 جيدا 340 & ل لوحة تخزين</td><td>لوحة فالكون</td><td>353263</td><td>قاع V ، مقياس تدفق البولي بروبلين الطبيعي</td></tr><tr><td>قسطرة</td><td></td> BD <td>Biosciences</td> BD Biosciences 393202 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

القصبات الغسل من الفئران الرئتين لتحليل التهاب تسلل خلية

Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration

القصبات القصبي (بال) هو إجراء تجريبي يستخدم لدراسة المحتوى الخلوي والخلوي من التجويف الرئة السابقين الجسم الحي للحصول على نظرة ثاقبة حالة المرض الجارية. هنا، وصفت طريقة بسيطة وفعالة لأداء بال على الرئتين الفئران دون الحاجة إلى أدوات خاصة أو المعدات. يتم عزل السائل بال عن طريق إدخال قسطرة في القصبة الهوائية من الفئران تخدير انتهائية، من خلالها يتم غرس محلول ملحي في القصيبات. يتم سحب السائل الغرس بلطف لتعظيم استرجاع السوائل بال وتقليل قوى القص. هذه التقنية تسمح بقاء، وظيفة، وهيكل الخلايا داخل الشعب الهوائية والسوائل بال للحفاظ عليها. ويمكن تطبيق العديد من التقنيات للحصول على مزيد من الفهم لحالة المرض من الرئة. هنا، تقنية شائعة الاستخدام لتحديد وتعداد أنواع مختلفة من الخلايا المناعية هووصفها، حيث التدفق الخلوي وجنبا إلى جنب مع لوحة مختارة من علامات محددة سطح الخلية fluorescently المسمى. ويمكن أيضا إجراء BAL المعروضة هنا أن تستخدم لتحليل العوامل المعدية، مكونات السوائل، أو الجسيمات المستنشقة داخل الرئتين الفئران.

بعد أداء بال مع 3x 1 مل من محلول الملح مخزنة، ينبغي استرداد حجم بين 2 و 3 مل. هذا السائل بال يمكن تحليلها أكثر لتوصيف محتوى الخلوية وغير الخلوية. للتحقيق في وجود السيتوكينات و تشيموكينس، إليسا 19 ، إمونوبلوت 20 ، والتحليل في وقت واحد من السيتوكينات متعددة من قبل مجموعة حبة السيتوكين 21 لا يمكن أن يؤديها. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تحديد الزلال ومجموع محتوى البروتين من هذا السائل 22 . على سبيل المثال، تصف هذه المخطوطة كيفية تحليل المحتوى الخلوي للسوائل بال عن طريق التدفق الخلوي. تم جمع السائل بال تحليلها من الإناث البلب / كانكرل الفئران (عمر: 7 أسابيع) 24 ساعة بعد أن غرس داخل إنتراتراشيلي مع عديد السكاريد الشحمي. الأجسام المضادة التالية، إلى جانب فلورفور، ثتستخدم لتحديد أنواع مختلفة من الخلايا: CD11c و سيغليسف و مسيي و CD3ε و CD19 و Ly6g و CD11b (انظر الجدول 1 وجدول المواد ). كما تم استخدام صبغ قابلية للتثبيت. باستخدام استراتيجية الانطلاق على أساس التعبير التفاضلي للمستضدات على أسطح السكان الخلايا المختلفة ( الشكل 1 )، كان من الممكن تحديد الضامة والخلايا الجذعية والخلايا B والخلايا التائية، العدلات، والحمضات. أولا، كانت الحطام والمزدوجة موصولة على أساس معلمات التشتت الأمامية والجانبية. وسهلت صبغة البقاء على قيد الحياة النابضة على الخلايا الحية. بعد ذلك، تم تحديد خلايا CD11c عالية وخلايا CD11c منخفضة. في CD11c ارتفاع السكان، والضامة والخلايا الجذعية تم تحديدها على أساس مسي و سيغليف التعبير، على التوالي. في CD11c منخفض السكان، تم تحديد الخلايا التائية والخلايا ب على أساس CD3ε و CD19 التعبير، على التوالي. في ثتم تحديد السكان الخلية المتبقية، العدلات والحمضات على أساس CD11b ولي -6G التعبير علامة، على التوالي. تم إضافة الخرز عد لتحديد أعداد الخلايا المطلقة من السكان خلية مختلفة من خلال مقارنة نسبة الأحداث حبة لأحداث الخلية 23 . تم تحديد هذه الخرز العد على أساس خصائصها إلى الأمام والانتثار الجانبية ( الشكل 1 ). الجدول 4 يعطي لمحة عامة عن أعداد الخلايا المطلقة من السكان خلية مختلفة في السائل بال من الفأر السذاجة والماوس الذي تم تحفيز لمدة 24 ساعة مع 5 ميكروغرام من عديد السكاريد الدهني. <img alt="شكل 1" src="/files/ftp_upload/55398/55398fig1.jpg" /> الشكل 1: استراتيجية الصابورة للكشف عن سايتوميتريك التدفق من الضامة، خلايا شجيري، خلايا T، خلايا B، العدلات، والحمضات طn بال السوائل. تم عزل الخلايا بال باستخدام بروتوكول بال وصفها. تم عزل الخلايا من الفئران 24 ساعة بعد تقطير داخل الرغامى من عديد السكاريد الشحمي. تم تحديد حبات العد والخلايا بناء على خصائص التشتت الأمامية والجانبية. في بوابة الخلية، تم التعرف على خلايا واحدة باستخدام مبعثر إلى الأمام والجانب. في هذه المجموعة السكانية الأخيرة، تم تحديد الخلايا التي كانت على قيد الحياة. ثم تم تحديد الخلايا CD11c عالية و CD11c الخلايا المنخفضة . في CD11c ارتفاع السكان، والضامة والخلايا الجذعية تم تحديدها على أساس مسي و سيغليف التعبير، على التوالي. في CD11c منخفض السكان، تم تحديد الخلايا التائية والخلايا ب على أساس CD3ε و CD19 التعبير، على التوالي. في السكان الخلية المتبقية، تم تحديد العدلات والحمضات على أساس CD11b ولي -6G التعبير، على التوالي. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55398/55398fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض</a>نسخة أكبر من هذا الرقم. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> السكان الخلية </td><td> العدد المطلق للخلايا في الفئران السذاجة </td><td> العدد المطلق للخلايا في LPS حفز الفئران </td></tr><tr><td> البلاعم </td><td> 79612 </td><td> 25439 </td></tr><tr><td> الخلايا الجذعية </td><td> 495 </td><td> 671 </td></tr><tr><td> خلايا T </td><td> 45271 </td><td> 28089 </td></tr><tr><td> خلايا B </td><td> 4164 </td><td> 2926 </td></tr><tr><td> العدلات </td><td> 632 </td><td> 566716 </td></tr><tr><td> الحمضات </td><td> 3483 </td><td> 4332 </td></tr></tbody></table> الجدول 4: تمثيلاتاتيف نتائج تحليل التدفق الخلوي على السوائل بال من الفئران السذاجة و لس حفز.

وينعكس الوضع الصحي للرئة عن طريق نوع وعدد الخلايا المناعية الموجودة في القصبات الرئوية. نحن تصف تقنية غسل القصبات التي تسمح العزلة ودراسة الخلايا غير متماثلة والعوامل القابلة للذوبان من الجهاز التنفسي السفلي من الفئران.

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain ...

الهدف العام من هذا الإجراء هو جمع المحتويات الخلوية وغير الخلوية من تجويف الرئة عبر غسيل القصبات والأسناخ لإجراء تحليلات خارج الجسم الحي وتقييم حالة المرض المستمرة لدى الحيوان. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال مناعة الجهاز التنفسي حول الآليات المناعية المستحثة بالعدوى والالتهاب من خلال قياس الاستجابات الخلوية والخلطية الفطرية في الرئة. وتتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية في كونها بسيطة وفعالة وقابلة للتكرار بدرجة عالية، ولا تتطلب معدات أو أدوات خاصة.قبل البدء في الإجراء، قم بتجهيز القسطرة عن طريق إدخال إبرة عيار 23 في قطعة طولها 0.5 centimeter من أنابيب البولي إيثيلين البلاستيكية الشفافة عيار 21، ثم ضع الحيوان في وضعية الاستلقاء الظهري. قم بتثبيت أطراف الفأر وتطهير منطقة الرقبة باستخدام 70%ethanol. بعد ذلك، استخدم المشرط لإجراء شق جلدي بالقرب من الرغامي.افتح الجلد للكشف عن الغدد اللعابية واستخدم الملقط لفصل الغدد وإظهار العضلة اللامية القصية. استخدم الملقط لشق العضلة حول الرغامي. وعندما تصبح الرغامي مرئية، استخدم الملقط لتمرير خيط جراحي قطني تحت أنسجة الرغامي.بعد ذلك، استخدم إبرة بقياس 26 gauge لثقب منتصف الرغامي بعناية بين حلقتين غضروفيتين، ثم أدخل القسطرة المُجهزة مسبقاً لمسافة 0.5 centimeters تقريباً داخل تجويف الرغامي. قم بتثبيت القسطرة باستخدام الغرزة الجراحية. بعد ذلك، املأ حقنة سعة one milliliter بـ one milliliter من محلول ملحي متوازن معقم مضاف إليه 100 micromolar EDTA.قم بتوصيل المحقنة المملوءة بالقثطرة وحقن محلول الملح المتوازن وEDTA برفق في الرئة. عند الانتهاء من حقن كل المحلول الملحي، قم بسحب المحلول برفق مع تدليك الصدر. من المهم جداً توخي الرفق عند حقن واستعادة السائل في الحالة الصلبة لزيادة استعادة سائل BAL وتقليل قوى القص.إذا تسرب السائل الصلب عبر الأنف، قم بإعادة تثبيت الغرزة على طول القسطرة. وعندما يتم جمع كافة السوائل المشفوطة، انقل السائل إلى أنبوب سعة 15 milliliter على الثلج وكرر عملية الغسل مرتين إضافيتين. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إتمامها في غضون سبع دقائق إذا تم تنفيذها بشكل صحيح.بعد عملية جمع الغسيل القصبي السنخي الثالثة، قم بطرد الرواسب من المادة المشفوطة المجمعة وخزن السائل الطافي عند درجة حرارة 80- درجة مئوية. أعد تعليق الراسب في 200 microliters من منظم ACK lysis buffer. وبعد مرور دقيقتين كحد أقصى في درجة حرارة الغرفة، خفف منظم lysis buffer باستخدام 1 milliliter من PBS البارد واجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي.أعد تعليق الراسب في الحجم المناسب من PBS بما يتناسب مع عدد العينات المراد تحليلها، ثم وزع الخلايا في العدد المناسب من آبار طبق 96 well plate لإجراء التحليل. اجمع الخلايا عن طريق عملية طرد مركزي أخرى، وأعد تعليق الرواسب في 50 microliters من FC Block و PBS. بعد 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة، أضف 50 microliters من مزيج الأجسام المضادة المناسب والمطلوب إلى كل بئر، واحضر الخلايا لمدة 30 دقيقة عند 4 degrees celsius مع حمايتها من الضوء.في نهاية فترة الحضن، يتم طرد plate مركزياً والتخلص من السائل الطافي، ثم إعادة تعليق الرواسب في حجم نهائي قدره 200 microliters من FAX buffer لكل بئر لإجراء تحليل التدفق الخلوي. وباستخدام استراتيجية بوابية تعتمد على التعبير التفاضلي للمستضدات على أسطح مجموعات خلايا غسيل القصبات والأسناخ المختلفة، يمكن تحديد مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا المناعية. ويتم تحديد بوابات الخلايا والخلايا المفردة وفقاً لخصائص التشتت الأمامي والجانبي الخاصة بها.يتم تحديد بوابات الخلايا السلبية لصبغة الحيوية/الموت، يلي ذلك تحديد الخلايا ذات التعبير المرتفع عن Cd11c (Cd11c High) والخلايا ذات التعبير المنخفض عن Cd11c (Cd11c Low). وفي مجموعة Cd11c High، يمكن تحديد الخلايا البلعمية والخلايا الشجرية بناءً على تعبيرها عن MHC-II و SinglecF على التوالي. أما في مجموعة Cd11c Low، فيمكن تحديد الخلايا التائية والخلايا البائية بناءً على تعبيرها عن CD3/CD19 و MHC-II على التوالي.في الخلايا المتبقية، يمكن تحديد الخلايا الحمضية (eosinophils) والخلايا المتعادلة (neutrophils) من خلال تعبير مؤشر Cd11b أو Ly-6G على التوالي. كما يمكن إضافة حبيبات العد (Counting beads) لتحديد الأعداد المطلقة لمجموعات الخلايا المختلفة عن طريق مقارنة نسبة أحداث الحبيبات إلى أحداث الخلايا، على سبيل المثال، في الحيوانات الساذجة (naive) مقابل الحيوانات المحفزة بـ LPS. بعد جمع سائل غسيل القصبات والأسناخ (BAL)، يمكن إجراء تقنيات أخرى مثل مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) أو اللطخة المناعية (immunoblot) أو مصفوفة حبيبات السيتوكين (cytokine bead array) للإجابة على أسئلة إضافية حول المحتوى غير الخلوي لسائل BAL.بعد تطوير هذه التقنية، مهدت الطريق للباحثين في مجال علم المناعة لاستكشاف المحتوى الخلوي واللاخلوي للتجويف الرئوي لدى الفئران. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء عملية غسل القصبات والأسناخ الرئوية (BAL) بكفاءة وقابلية للتكرار.

bronchoalveolar-lavage-murine-lungs-to-analyze-inflammatory-cell

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

علم المناعة والعدوى

القياسات المتكررة لفسيولوجيا الجهاز التنفسي القوارض وأخذ العينات من الخلايا الهوائية الملتهبة مرغوب فيها ، ولكن عموما ليست مجدية. نحن هنا تصف طريقة لتكرار intubating شفويا الفئران التي تسمح القياسات المتكررة لhyperreactivity الهوائية وأخذ العينات من الخلايا الهوائية الملتهبة.

A عكسية ، غير الغازية طريقة لقياس مقاومة مجرى الهواء وأخذ عينات السوائل غسل القصبات في الفئران

نحن لتوضيح غير الجراحية تسليم مواد الاختبار في الرئتين من الفئران تخدير عن طريق القصبة الهوائية. هذا الأسلوب يسمح الرئة التعرض لمسببات الأمراض البكتيرية والفيروسية ، السيتوكينات ، والأجسام المضادة ، والخرز ، والمواد الكيميائية ، أو الأصباغ. ونحن كذلك وصف حصاد وتجهيز الرئتين والعقد اللمفاوية استنزاف الرئة (LDLNs) لالتدفق الخلوي.

غير الجراحية التقطير داخل الرغامى من الفئران مع تحليل الرئتين والعقد الليمفاوية والرئة التي تصريف التدفق الخلوي

المصدر: Venuprasad, K., et al. إعطاء المستدمية النزلية داخل القصبة الهوائية في نماذج الفئران لدراسة التهاب مجرى الهواء. J. Vis. خبرة. (2016)يوضح هذا الفيديو جمع ومعالجة سائل الغسيل القصبي السنخي من فأر تم القتل الرحيم مصاب بالمستدمية النزلية غير القابلة للكتابة لتحليلها النهائي.

مجموعة سوائل الغسيل القصبية السنخية من نموذج فأر مصاب بالمستدمية النزلية غير القابلة للكتابة

يوضح هذا الفيديو استخدام قياس التدفق الخلوي لتحديد وحساب الخلايا المناعية المختلفة في سائل غسل القصبات الهوائية. في البداية ، يتم تحديد الخلايا المناعية المفردة باستخدام صبغة قابلة للحياة ، متبوعة بالتلوين التفاضلي لبروتينات العلامات السطحية ، مما يتيح التعداد الدقيق لكل نوع من أنواع الخلايا.

تحديد وتعداد الخلايا المناعية في سائل الغسيل القصبي السنخي عن طريق قياس التدفق الخلوي

يوضح هذا الفيديو تقنية في المختبر لتحديد الخلايا المناعية الموجودة في رئتي الفئران. بعد عزل الخلايا المناعية المستهدفة من أنسجة رئة الفئران ، يتم تصنيفها على السطح باستخدام مزيج من الأجسام المضادة الموسومة بالفلوروفور ضد علامات محددة على الخلايا المناعية الفطرية والتكيفية. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تصنيف الخلايا الوحيدة والضامة والخلايا المتغصنة باستخدام علامة داخل الخلايا. ثم يتم تحديد أنواع الخلايا المناعية المختلفة باستخدام قياس التدفق الخلوي.

طريقة في المختبر لتحديد الخلايا المناعية الفطرية والتكيفية الموجودة في رئتي الفئران

استجابة المضيف المناعية للإصابة الممرض هو عملية تنظيم محكم. الاستفادة من وجود عديد السكاريد الشحمي الرئة نموذج التعرض في الفئران، وأنه من الممكن إجراء تقييمات عالية الدقة من الآليات المعقدة المرتبطة المرضية المرض.

والاستفادة من البلعوم الإدارة داخل القصبة الهوائية والقصبات PAMP الغسل لتقييم استجابة المضيف المناعية في الفئران

نحن تصف طريقة لإحداث الالتهاب الرئوي العدلات التي كتبها تحديا للعديد السكاريد الشحمي رذاذ بالإرذاذ، لنموذج إصابة الرئة الحادة. بالإضافة إلى ذلك، كما وصفت التقنيات الجراحية الأساسية لعزل الرئة، التنبيب الرغامي والقصبات غسيل.

وهناك طريقة لتوليد الرئوي العدلات عن طريق رذاذ lipopolysaccharide في

وقد وصفت العديد من الطرق في الأدب لنمذجة الالتهاب الرئوي الجرثومي في الفئران. هنا، نحن تصف غير الغازية، وغير مكلفة، طريقة سريعة لإحداث الالتهاب الرئوي عن طريق الطموح (أي استنشاق) من اللقاح البكتيري pipetted في البلعوم. طرق المصب لتقييم الاستجابة المناعية الفطرية الرئوية هي أيضا مفصلة.

والطريقة غير الغازية ومن الناحية الفنية غير كثيفة للتحريض وPhenotyping التجريبية البكتيرية والالتهاب الرئوي في الفئران

تظهر الفئران المتعرضة للأوزون والبكتيريا مجتمعة موت الخلايا واسع الانتشار، بما في ذلك موت العدلات. لاحظنا التكيفات الخلوية مثل تعطيل اللاميلبوديا الهيكل الخلوي، وزيادة التعبير الخلوي من وحدة فرعية V ATP synthase المعقدة β والأنجيوستاتين في الحمم الهوائية القصبية، وقمع الاستجابة المناعية الرئة وتأخير تجنيد العدلات.

تصور التكيفات الخلوية الرئة خلال الأوزون المشترك وLPS الناجمة عن إصابة الرئة مورين الحادة

في هذه الدراسة ، نقدم بروتوكولا فعالا وقابلا للتكرار لعزل السكان المناعيين للجهاز التنفسي الفئراني. كما نقدم طريقة لتحديد جميع الخلايا المناعية الفطرية والتكيفية التي توجد في رئتي الفئران السليمة ، باستخدام لوحة قياس التدفق الخلوي القائمة على 9 ألوان.

تحليل التدفق الخلوي لتحديد الخلايا المناعية الفطرية والتكيفية للرئة الفخذية

هنا ، نصف قياس السعال باستخدام نظام تخطيط التحجم لكامل الجسم (WBP) غير الجراحي وفي الوقت الفعلي والإجراءات المعيارية لحصاد عينات الأنسجة من الفئران ونقدم بعض الطرق لتقييم التهاب مجرى الهواء.

طرق للكشف عن السعال والتهاب مجرى الهواء في الفئران

تعلم تقنية القصبات الغسل لعزل الخلايا المناعية من رئات الفئران. تُمكّن هذه الطريقة البسيطة والفعالة الباحثين من تقييم الاستجابات المناعية التنفسية وآليات الالتهاب بدقة عالية.

القصبات الغسل من الفئران الرئتين لتحليل التهاب تسلل خلية

استكشف المزيد من الفيديوهات