تبخر تخفيض الشرط الثقافة يزيد من القدرة على التكاثر من متعددة الخلايا كروي التشكيل في صفيحة معايرة دقيقة

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحسين قابلية التوسع والتكاثر لتكوين كروي موحد باستخدام تقنية تراكب سائل في 384 لوحة بئر. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تقلل من إعادة التشغيل الوسيط المفرط من لوحات متعددة ، وبالتالي تحسين قابلية استنساخ تكوين كروي. لقد قمنا بتطوير والتحقق من صحة طريقة زراعة الكرويات ثلاثية الأبعاد لاختبارات فحص المفصليات في مختبرنا وكانت دراستنا لتقييم تأثير الحافة في صفائح الثقافات متعددة الخلايا.

سأعرض اليوم الإجراء مع سونا ، وهو ملصق من المختبر. ابدأ هذا الإجراء عن طريق ترجيح نقطة الصفر وسبعة خمسة جرامات من الاغاروز المنخفض نقطة الانصهار وإضافته إلى 100 مل من وسط ماكوي 5a مع أو بدون فينول أحمر وبدون مصل. سخني المحلول في الميكروويف ولفيه كل دقيقة إلى دقيقتين لإذابة الاغاروز تماما.

ثم الأوتوكلاف المحلول لتعقيمه. بعد السماح للأغاروز المعقم بالتبريد إلى حوالي 70 درجة مئوية ، قم بتصفيته من خلال مرشح زجاجة 500 مليلتر من نقطة صفر اثنين من الميكرومتر في صندوق تدفق رقائقي. بعد ذلك ، إذا لم يتم استخدام الحل بأكمله مرة واحدة ، فقم بنقسه.

قم بتخزين محلول الاغاروز الجاهز للاستخدام بشكل معقم في غرفة باردة أو ثلاجة أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى أربعة أسابيع. العمل في صندوق التدفق ، قم بتثبيت كاسيت توزيع بلاستيكي أو معدني في موزع كاشف كومبي. ضع وزن الأنبوب في وعاء يحتوي على 70 في المائة من الإيثانول ثم قم بتجهيز الكاسيت.

بعد ذلك ، انقل وزن الأنبوب إلى وعاء من PBS وقم بتجهيزه مرة أخرى. بعد ذلك ، قم بتسخين كمية مخزنة من محلول الاغاروز المصفى في الميكروويف لإذابته. قم بتجهيز كاسيت الاستغناء بمحلول الاغاروز ثم ابدأ البروتوكول لطلاء 384 لوحة صغيرة معالجة بزراعة الأنسجة الجيدة ب 15 ميكرولترا من محلول الاغاروز المصفى.

اترك الاغاروز في الطبق ليبرد لمدة 15 إلى 20 دقيقة قبل زرع الخلايا كما هو موضح في القسم التالي من الفيديو ، أو تخزينها عند أربع درجات مئوية وبعيدا عن الضوء المباشر. أخيرا ، لتنظيف كاسيت التوزيع ، ضع وزن الأنبوب في ماء معقم من 70 إلى 80 درجة مئوية واضغط على الزر الرئيسي الموجود على الموزع. سيؤدي ذلك إلى إزالة أي أغاروز متبقي في أطراف الكاسيت والأنابيب.

يجب إجراء عملية بذر الخلايا التالية في ظل ظروف معقمة وفي صندوق تدفق رقائقي. ابدأ بإزالة العدد المطلوب من 384 من الصفائح الدقيقة المعالجة بزراعة الأنسجة الجيدة المطلية ب 384 من التخزين البارد والسماح لها بالتوازن مع درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. في غضون ذلك ، قم بإعداد موزع الكاشف المركب لرؤية الخلايا عن طريق تحضير كاسيت توزيع الأنبوب القياسي بنسبة 70 في المائة من الإيثانول و PBS المعقم.

بعد ذلك ، باستخدام أزرار الإعداد اليدوي على الموزع ، اضبط حجم الرؤية على الميكرولتر المطلوب وسرعة الاستغناء على متوسطة. استخدم إنزيم تفكك الخلايا المؤتلف لإزالة خلايا سرطان القولون والمستقيم البشرية الملتصقة HCT116 من قارورة زراعة الأنسجة. في دورق معقم ، قم بعمل مخزون معلق للخلية بخلايا بكثافة 2.5 مرة 10 إلى الخلايا الرابعة لكل مليلتر لكل بئر في 50 ميكرولتر من وسط النمو الكامل.

إذا تم زرع أكثر من صفيحة بئر 384 ، فاستخدم أداة تقليب مغناطيسية لمنعها من الاستقرار في قاع الدرق. باستخدام موزع ، أضف 25مائة خلية إلى كل بئر من 384 لوحة بئر. اترك الأطباق ترتاح لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

في هذه الأثناء ، خذ غطاء صفيحة دقيقة بيئية يقلل من التبخر وباستخدام ماصة سعة خمسة ملليلتر ، وقم بتوزيع أربعة ملليلتر من خمسة بالمائة من ثنائي ميثيل سلفوكسيد في حوض الجانب الأيسر ، مع المسح ببطء لأعلى ولأسفل. كرر هذه العملية مع حوض الجانب الأيمن. تأكد من أن السائل المضاف إلى الأحواض الجانبية لا يندمج في وسط الغطاء ويترك فجوة لتبادل الغاز.

إذا تمت إضافة الكثير من السائل ، فسوف يتسرب إلى الجزء الخارجي من الغطاء ثم يدخل لاحقا إلى البئر الخارجي للوحة زراعة الأنسجة 384. بعد مرور 30 دقيقة ، افحص الخلايا تحت المجهر. يسمح استراحة الصفائح لمدة 30 دقيقة للخلايا بالاستقرار تماما في قاع البئر وبالقرب من بعضها البعض ، وهو أمر مهم لتكوين كرويات مفردة لكل بئر.

الطرد المركزي للألواح المصنفة لمدة 15 دقيقة بأربع مرات G.بعد الدوران ، املأ الخزان السائل للوحة زراعة الأنسجة 384 بالماء المعقم واستبدل أغطية الألواح العادية بأغطية بيئية مملوءة بالسائل. ضع الصفائح في حاضنة دوارة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية مع رطوبة بنسبة 95 بالمائة ، وخمسة بالمائة من ثاني أكسيد الكربون ، و 20 في المائة من الأكسجين ، واسمح للخلايا بالتجمع في كرويات ورم متعددة الخلايا أو MCTS لمدة أربعة أيام. تجنب فتح باب الحاضنة لفترة طويلة في الأيام اللاحقة حتى لا ينخفض مستوى الرطوبة فجأة.

في اليوم الرابع بعد تكوين NCTS ، استخدم موزع غسالة دقيق آلي لإضافة 30 ميكرولترا من الوسط الدافئ مسبقا إلى كل بئر. ضع MCTSs مرة أخرى في الحاضنة واسمح ل MCTSs بالنمو حتى تصل إلى الحجم المطلوب للتجريب. كل ثلاثة أيام ، لاستبدال الوسط ، اضبط تجريبيا ارتفاع Z لمشعب الغسالة واضبط سرعة الاستغناء والسرعة التي ينتقل بها مشعب الغسيل إلى الآبار بأقل معدل لتقليل الاضطراب في الآبار.

استنشق 30 ميكرولترا من الوسط لكل بئر واستبدلها ب 30 ميكرولترا من الوسط الطازج الدافئ مسبقا. ثم أعد الخلايا إلى الحاضنة. صور MCTSs في نظام تصوير آلي عالي المحتوى باستخدام كائنات هواء أربعة X بفتحة عددية تبلغ 16.

باستخدام برنامج التصوير، اضبط وقت التعريض الضوئي على 11 مللي ثانية والتجميع على أربعة في أربعة. اضبط عدد وتباعد مكدسات z وتجميع وحدات البكسل حسب الرغبة حتى تتمكن التجربة من التقاط MCTS بالكامل في كل بئر. قم بمعالجة الصور ثنائية الأبعاد خطوة بخطوة لقياس منطقة MCTS والمحور الرئيسي والصغير والمحيط والصلابة.

يرجى الاطلاع على الرمز الرقمي المصاحب وملفات قراءة النص للحصول على إرشادات محددة. لتحديد قابلية التطبيق المحتملة للروتين ، تم علاج MCTSs البالغة من العمر سبعة أيام بتركيزات مختلفة من الأدوية المضادة للسرطان ، Paclitaxel ، PTX ، Vincristine ، VCR ، Oxalyplatin ، OXA ، Doxyrubicin ، DOX ، وخمسة فلوروراسيل ، 5-FU ، بثلاثة تركيزات مختلفة لمدة أربعة أيام. يتم عرض صور MCTSs هنا.

تم تحليل هذه الصور لتحديد المنطقة والمحاور الرئيسية والثانوية ومحيطها وصلابة MCTSs المعالجة بالأدوية مقارنة بالضوابط ، CTLs. تم استخدام المحاور الرئيسية والثانوية لحساب الحجم الهندسي. كان هناك انخفاض يعتمد على التركيز في منطقة MCTS وحجمها بعد العلاج بتعاطي المخدرات.

على الرغم من أن النقطة صفر واحد ميكروغرام لكل مليلتر من Vincrystine ونقطة الصفر أربعة ميكروغرام لكل مليلتر من Doxyrubicin وخمسة Fluorouracil أدت إلى زيادة في منطقة MCTS ، إلا أن الحجم زاد بشكل كبير فقط بعد النقطة صفر صفر واحد ميكروغرام لكل مليلتر Vincrystine. كان محيط MCTS مختلفا بشكل ملحوظ فقط عند أعلى تركيزات من Packlitaxel و Doxyrubicin و Five Fleurouracil مما أثر تماما على حجم MCTS. أدى العلاج باستخدام Packlitaxel و Vincrystine عند نقطة الصفر اثنين من خمسة ميكروغرام لكل مليلتر ونقطة صفر صفر ستة ميكروغرام لكل مليلتر و Doxyrubicin و Five Fleurouracil عند 100 ميكروغرام لكل مليلتر ، إلى انخفاض كبير في الصلابة ، مما يشير إلى تفكك كامل إلى جزئي ل MCTSs.

توضح هذه البيانات مجتمعة فائدة هذه الطريقة في التحقيق في الأدوية المحتملة المضادة للسرطان. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في غضون ساعتين إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. عند محاولة هذا الإجراء ، من المهم ملاحظة أنه ليست كل خطوط الخلايا مناسبة لطريقة ثقافة ثلاثية الأبعاد معينة وأن خطوط الخلايا المختلفة تشكل كرويات تظهر اختلافات في الأشكال الكروية والحجم والأنسجة وحركية النمو.

يسمح الروتين التحزيزي الذي طورناه بالتقييم الفعال لحجم الكروي ، لا سيما في الكرة الكروية المعالجة بالمخدرات المتفككة جزئيا والتي ليس لها حدود محددة بوضوح لقياس مساحة المقطع العرضي. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لحقيقة أن التعديل الموجود هنا لا يتطلب أي معدات أو مواد استهلاكية إضافية ويمكن تنفيذه بشكل روتيني في مختبر فحص المفصليات.