بروتوكول الآلي السريع لالعضلات تحليل الألياف السكان في الجرذ العضلات المقاطع العرضية عن طريق سلسلة الميوسين الثقيلة المناعية

الهدف العام من هذه الطريقة هو توجيه عملية تقدير كمية الألياف العضلية في عضلات الجرذ الكاملة بسرعة وموثوقية، وبطريقة آلية ومستقلة عن المستخدم باستخدام منصة مفتوحة المصدر. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال الجهاز العصبي العضلي حول تأثيرات الشيخوخة، أو المرض، أو الصدمات على العضلات الهيكلية. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في إمكانية استخدامها لتحليل مجموعات الألياف العضلية بموثوقية وإنتاج صور عالية الجودة للمقاطع العرضية للعضلات.

بعد الإذابة الكافية، اغسل العينات بعناية في محلول PBS مضاف إليه Triton X، أو PBST، من خلال غسلة واحدة لمدة 10 دقائق وغسلة واحدة لمدة خمس دقائق. بعد الغسلة الثانية، اترك المقاطع لتجف في الهواء لمدة دقيقتين. ثم، استخدم قلماً كارهاً للماء لإحاطة المقاطع العرضية الفردية.

بعد 15 دقيقة أخرى من التجفيف بالهواء، قم بحجب أي ارتباط غير متخصص باستخدام PBST المضاف إليه مصل الماعز لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، اغسل الشرائح وأضف مزيج الأجسام المضادة الأولية المناسب إلى كل عينة للتلوين لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع الحماية من الضوء. وفي نهاية فترة الحضن، اشطف الشرائح بغسلة واحدة من PBST لمدة 10 دقائق وغسلة أخرى لمدة خمس دقائق.

بعد ذلك، قم بتوسيم مقاطع العضلات باستخدام مزيج الأجسام المضادة الثانوية المناسب لمدة ساعة واحدة مع الحماية من الضوء. بعد غسل الشرائح مرتين في PBST، كما هو موضح، جفف الشرائح ثم صبغ النوى باستخدام طقم صبغ النوى DAPI وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة. أزل فائض DAPI بغسلها بـ PBST لمدة دقيقة واحدة، يليه تجفيف سريع في الهواء.

بعد ذلك، قم بتغطية العينات بوسط تثبيت فلوري وشريحة غطاء، واحفظ الشرائح عند درجة حرارة 4 °C بعيداً عن الضوء. وفي غضون 24 إلى 48 ساعة من التلوين، قم بتحميل الشرائح في ماسح الشرائح وافتح مشروعاً جديداً في برنامج التشغيل. لمعاينة الشريحة، اختر قناة DAPI والعدسة 2.5x، وقم بضبط التركيز يدوياً على العينة الأولى.

حدد كل مقطع عرضي يجب تضمينه في عملية الاستحواذ التفصيلية، واضبط أوقات التعريض لكل قناة. الآن، ابدأ عملية الاستحواذ التلقائي على الصور، مع التحقق من الاستحواذ الصحيح لمجال الرؤية الأول، وذلك لمنع حدوث أي خطأ في الاستحواذ في مرحلة مبكرة من العملية الآلية. عند اكتمال الاستحواذ على الصور، تحقق يدويًا من أن التركيز التلقائي للمقاطع العرضية صحيح وأن الألياف الفردية يمكن تمييزها بوضوح.

من الضروري التحقق من التركيز التلقائي وتصحيحه يدويًا لكل صورة حسب الحاجة. تتطلب عملية التحديد الكمي الآلي للألياف العضلية صورًا عالية الجودة للحصول على نتائج مثالية. بعد ذلك، وبالنسبة لكل مقطع عرضي يجب إدراجه في التحليلات النهائية، قم بتصدير كل قناة بشكل منفصل كملفات JPEG باستثناء قناة DAPI، وقم بتسمية الملفات وفرزها في المجلدات المسماة بشكل مناسب وفقًا للقنوات المعرضة.

قبل البدء في عملية تقدير كمية الألياف العضلية، قم بمعاينة كل صورة باستخدام برنامج تحرير الصور المناسب للتأكد من وجود تباين كافٍ بين الألياف المصبوغة والخلفية. بعد ذلك، في برنامج ImageJ، استخدم الأمر Plugins>Macros>Edit لإظهار الكود المصدري للماكرو، وقم بتغيير دليل المجلد لكل قناة في الكود المصدري للماكرو. الآن، استخدم الأمر Run لبدء تشغيل الماكرو.

سيتم تحميل جميع الصور الموجودة في المجلد إلى الماكرو وقياسها كمياً بترتيب متتابع. وفي نهاية عملية القياس الكمي، قم بتصدير النتائج إلى برنامج الجداول البيانات المناسب، وحدد قيم الألياف البطيئة والمتوسطة والسريعة التي تم عدّها بشكل إيجابي. ومن ثم يمكن حساب العدد الإجمالي للألياف.

تتميز صبغ الألياف العضلية بالفلورة المناعية بالسرعة مع حدوث تفاعل تبادلي طفيف، وتظهر الصور الناتجة تباينًا عاليًا بين الألياف المصبوغة والأنسجة المحيطة، بالإضافة إلى تمييز قوي بين أنواع الألياف المختلفة. ويسمح التحليل الآلي بالكشف عن المجموعات النسبية للألياف العضلية بدقة تبلغ زائد أو ناقص 4% مقارنة بالتحليل اليدوي، مع ارتفاع إجمالي التعدادات المطلقة مقارنة بالتحليل اليدوي. ومع ذلك، تظل التعدادات النسبية متشابهة، ضمن نطاق زائد أو ناقص 4%.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام هذه الطريقة لأتمتة تقدير كمية الألياف العضلية. لا تنسَ أن العمل باستخدام DAPI يمكن أن يكون خطيرًا، لذا يجب ارتداء معدات الوقاية المناسبة أثناء إجراء عملية الصبغ.