عزل وتوصيف وتنقية الضامة من الأنسجة المتضررة من التهاب المتصلة بالسمنة

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل وتوصيف الخلايا البلعمية (macrophages) بفعالية من الأنسجة التي تتأثر عادةً بالالتهابات الناجمة عن النظام الغذائي، مثل الكبد. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجالات علم المناعة والالتهابات حول كيفية تأثير النمط الظاهري للخلايا البلعمية المقيمة في الأنسجة على تطور الأمراض الالتهابية المزمنة. وتكمن الميزة الرئيسية في أن هذا الإجراء يحسن خطوات العزل اللازمة للحصول على معلقات من الخلايا المفردة المشتقة من الأنسجة المتأثرة بالالتهابات المزمنة منخفضة الدرجة الناجمة عن السمنة.

ستقوم جوسلين ألين، وهي طالبة دراسات عليا في مختبري، بشرح الإجراء. لعزل الكبد، ضع أولاً فأراً منقوعاً في الإيثانول في وضعية الاستلقاء الظهري على لوح تشريح من رغوة البوليسترين وثبّت القوائم الأمامية والخلفية. بعد ذلك، استخدم ملقطاً ذا طرف متوسط المدببة للإمساك بجلد البطن بالقرب من فتحة الإحليل، واستخدم مقص تشريح حاداً لإجراء شق صغير في الجلد المرتفع.

أدخل الشفرة السفلية للمقص في الشق الموجود بين الجلد والبريتون، ثم قم بإجراء شق جانبي من المنطقة الإربية وصولاً إلى الذقن. اسحب الجلد برفق للكشف عن التجويف البريتوني السليم والجدار الصدري، ثم قم بإجراء شق جانبي عبر البريتون. ارفع عظمة القص واشق الحجاب الحاجز بعناية.

بعد ذلك، قم بإزاحة أعضاء الجهاز الهضمي إلى الجانب وحدد موقع الوريد الأجوف السفلي تحت الكبدي أو IVC. وباستخدام ملقط مرقئ، قم بضم الوريد الأجوف السفلي فوق الكبدي للحفاظ على تروية موضعية، ثم صِل محقنة مملوءة بمحلول تروية مُدفأ مسبقاً بطقم جمع ونقل دم عيار 23. اضغط برفق على المكبس حتى يمتلئ الأنبوب والإبرة بمحلول التروية، ثم أدخل الإبرة بشكل موازٍ للوريد الأجوف السفلي تحت الكبدي.

يضمن القسطرة الصحيحة للوريد الأجوف السفلي (IVC) توزيع محلول الفصل محلياً في جميع أنحاء الكبد والأنسجة الطرفية، مما يحسن من عملية هضم الأنسجة. استخدم مشبكاً مرقئاً بطول أربعة سنتيمترات لتثبيت الإبرة في مكانها، واضغط برفق على المكبس لبدء التروية. إذا كانت الإبرة في الموضع الصحيح، سيتلاشى اللون بسرعة من الكبد وستتضخم الفصوص.

اقطع الوريد البابي على الفور للسماح لمحلول التروية بالتدفق بحرية عبر الكبد، مع تدليك الفصوص بلطف بين الإبهام والسبابة من حين لآخر لتسهيل إزالة الدم. وعندما يتبقى خمسة ملليلترات فقط من محلول التروية، استبدل سرنجة محلول التروية بسرنجة مملوءة بمحلول تفكيك مسخن مسبقاً، مع الاستمرار في تدليك الفصوص بلطف وتروية الكبد حتى يتم هضمه بالكامل. تأكد من نجاح عملية الهضم عن طريق الضغط بلطف بالحافة غير الحادة لملقط في الفص الجانبي الأيسر.

يجب أن يظهر انبعاج على السطح يمتلئ ببطء بمجرد إزالة الملقط. بعد ذلك، قم بإزالة الإبرة واستخدم شفرة قصيرة مستقيمة من مقص تشريح لقطع الأربطة الموصلة بعناية لاستئصال الكبد بالكامل والمرارة. انقل الكبد إلى طبق سعة 10 centimeter يحتوي على 10 milliliters من وسط DMEM البارد جداً، واستخدم ملقطاً مسنناً للإمساك بالوريد الأجوف السفلي فوق الكبدي المقطوع.

باستخدام ملقط متوسط الرأس، قم بإجراء حركة كشط سريعة لكل فص لتحرير الخلايا من محفظة غليسون (Glisson's Capsule)، ثم مرر وسط DMEM المشبع عبر مصفاة خلايا بقطر 70 micrometer في أنبوب مخروطي سعة 50 milliliter على الثلج. لا يمكن تحقيق إنتاجية عالية من الخلايا الحية إلا من خلال تفكيك خلايا الكبد بشكل صحيح من محفظة غليسون. عند تجميع كافة الخلايا، اقلب الأنبوب لخلط معلق الخلايا برفق، ثم قم بترسيب الخلايا عن طريق الطرد المركزي.

انقل السائل الطافي إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 50 milliliter لإجراء ثلاث عمليات طرد مركزي إضافية بسرعة منخفضة. وبعد عملية الطرد المركزي الأخيرة، انقل السائل الطافي إلى أنبوب جديد سعة 50 milliliter وقم بطرد الخلايا مركزياً مرة أخرى بسرعة أعلى. بعد ذلك، أعد تعليق كتلة الخلايا غير المتنية في FACS buffer لغرض العد، وخفف خلايا الكبد إلى التركيز المناسب وفقاً للتطبيق اللاحق لها في أنابيب بوليسترين مستديرة القاع سعة 5 milliliter وموسومة.

تظهر الفئران التي تتغذى على نظام غذائي عالي الدهون أو نظام غذائي عالي الدهون والكوليسترول زيادة في ارتشاح البلاعم M1 المنشطة كلاسيكياً في الأنسجة المصابة مثل الشريان الأورطي. وتنخفض أعداد البلاعم في الشريان الأورطي الموجبة لـ CD45 والموجبة لـ F4/80 والمعبرة عن مستقبل RON، والتي تظهر نمطاً ظاهرياً مضاداً للالتهاب، في الفئران التي تتغذى على نظام غذائي عالي الدهون والكوليسترول، بينما توجد أعداد متزايدة من البلاعم المحفزة للالتهاب والموجبة لـ CD45 والموجبة لـ F4/80 والموجبة لـ CD11c في الشرايين الأورطية المعزولة من هذه الحيوانات. علاوة على ذلك، تظهر البلاعم المعبرة عن مستقبل RON التي تم فرزها من الشرايين الأورطية المهضومة زيادة في تعبير جين Arginase 1، وهو علامة معروفة للبلاعم M2.

في الواقع، يكشف توصيف البلاعم المقيمة في الكبد عن النمط الظاهري السائد للمجموعات الفرعية التي تعبر عن مستقبل RON مع مجموعات البلاعم المحفزة للالتهاب والموجبة لـ CD11c، والتي تظهر انخفاضاً في تعبير الجينات المرتبطة بقوة بالنمط الظاهري M2 المضاد للالتهاب. وتُلاحظ اتجاهات مماثلة في مجموعات البلاعم المعزولة من النسيج الدهني الأبيض المهضوم، حيث تظهر مجموعات البلاعم ذات النمط الظاهري المحفز للالتهاب انخفاضاً في التعبير السطحي لمستقبل RON. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إكمالها في غضون 20 إلى 30 دقيقة لكل حيوان إذا نُفذت بشكل صحيح.

بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن إجراء طرق أخرى مثل قياس التدفق الخلوي، وفرز الخلايا المنشط بالفلوريسنت، و/أو تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي لمزيد من التوصيف للنمط الظاهري للبلاعم المقيمة في الأنسجة والمشتقة من الكبد والمعزولة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل البلاعم المقيمة في الأنسجة من الكبد المصاب بشكل صحيح. شكراً للمشاهدة وبالتوفيق في تجاربكم.