تحليل إنهاء النسخ عن طريق النسخ على تشغيل (TRO) نهج BrUTP حبلا محددة
مارس 12, 2017
نصف نهجا تجريبيا أساسيا لتحليل إنهاء النسخ بواسطة بوليميراز الحمض النووي الريبي II في الجسم الحي باستخدام BrUTP بواسطة نهج تشغيل النسخ الخاص بالخيوط (TRO) في الخميرة الناشئة. يمكن تمديد هذا البروتوكول لدراسة إنهاء النسخ بواسطة بوليميرات الحمض النووي الريبي الأخرى في كل من الخميرة وحقيقيات النوى الأعلى.
الهدف العام من هذا الإجراء هو دراسة إنهاء النسخ بواسطة بوليميراز الحمض النووي الريبي إلى الخميرة الناشئة في ظل ظروف في الجسم الحي عن طريق تشغيل النسخ الخاص بالخيط عند النهج. تساعد هذه الطريقة في الإجابة على السؤال الرئيسي حول ما إذا كان البوليميراز النشط النسخي الذي تم اكتشافه خارج الطرف الرئيسي الثلاثة للجين هو الذي بدأ من منطقة المحفز. الميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي أنها يمكن أن تميز MRNA الذي ينسخ البوليميراز من البوليميراز النسخ المنتشر والذي بدأ النسخ وسيكون في الطرف الرئيسي الثلاثة للجين.
يمكن توسيع هذه التقنية لدراسة إنهاء النسخ بواسطة بوليميرات الحمض النووي الريبي والخميرة الأخرى بسبب طبيعة الحفاظ على الإنهاء بواسطة البوليميرات المختلفة. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة للدور الدقيق لعوامل الإنهاء في دورة نسخ الخميرة ، إلا أنه يمكن أيضا توسيعها لدراسة الإنهاء في حقيقيات النوى الأعلى. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة من نفاذية الخلايا وتشغيل النسخ عند التوقفات ، لأنها تتطلب تنفيذا دقيقا ، وقد يكون من الصعب أيضا تنقية النصوص الوليدة.
خطرت لنا لأول مرة فكرة هذه الطريقة من نهج البحث GRO الذي يعطي لمحة واسعة عن الجينوم لموضع البوليميرات النشطة نسخيا بطريقة محددة للخيوط. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية ، حيث يصعب إجراء تشغيل النسخ وتنقية الحمض النووي الريبي بسبب الكمية المنخفضة والطبيعة غير المستقرة للنصوص الوليدة. قبل بدء النسخ ، قم بتشغيل التفاعل ، وتنمو ، وحصادت ، ونفاذة خلايا الخميرة التي تنمو بشكل كبير ، للحصول على منصة نقالة خلية نفاذة.
لبدء التفاعل ، أضف 150 ميكرولترا من النسخ ، قم بتشغيله على المخزن المؤقت إلى لوحة الخلايا المنفذة. باستخدام طرف P-200 مقطوع ، امزج برفق عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل. ضع العينة على الثلج.
بعد إعادة تعليق جميع العينات في تشغيل النسخ على المخزن المؤقت ، احتضان العينات لمدة خمس دقائق عند 30 درجة مئوية في حمام مائي. أوقف التفاعل عن طريق إضافة 500 ميكرولتر من الكاشف البارد الجاهز للاستخدام لعزل الحمض النووي الريبي إلى كل عينة. احتضن لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.
ابدأ إجراء استخراج الحمض النووي الريبي بإضافة 200 ميكرولتر من الخرز الزجاجي المغسول بالحمض إلى كل معلق خلية ورجها بقوة في خلاط دوامة لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية. بعد 20 دقيقة ، استخدم إبرة ساخنة قياس 22 لثقب الجزء السفلي من كل أنبوب طرد مركزي دقيق ووضع الأنبوب أعلى أنبوب مخروطي معقم سعة 15 مل. جهاز طرد مركزي عند 300 مرة G لمدة دقيقة واحدة عند أربع درجات مئوية ونقل محللة الخلية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر.
أضف 500 ميكرولتر من كاشف عزل الحمض النووي الريبي البارد ، و 200 ميكرولتر من الكلوروفورم إلى محللة الخلية. امزج المحتويات الموجودة على الخلاط الدوامي ثم جهاز الطرد المركزي على حرارة 16 ، 168 مرة جم لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية. نقل المرحلة المائية العلوية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد.
أضف كمية متساوية من كحول الفينول الكلوروفورم الأيزوأميل. رج العبوة بقوة على الخلاط الدوامي ثم جهاز الطرد المركزي عند 16 ، 168 مرة جم لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية. نقل المرحلة المائية العلوية التي تحتوي على الحمض النووي الريبي إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد.
أضف كمية متساوية من الفينول البارد وكلوروفورم وإيزوأميل الكحول والدوامة وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى. أضف إلى الحمض النووي الريبي النهائي الذي يحتوي على الطور المائي حجما مناسبا من مخزون كلوريد الصوديوم المكون من خمسة مولار للحصول على تركيز نهائي يبلغ 0.3 مولار. أضف ثلاثة أضعاف حجم الإيثانول البارد لترسيب الحمض النووي الريبي.
احتضن لمدة ساعة واحدة ، أو طوال الليل ، عند 20 درجة مئوية. عندما يتم ترسيب الحمض النووي الريبي ، قم بعمل جهاز طرد مركزي عند 16 ، 168 مرة G لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق لوحة الحمض النووي الريبي في 100 ميكرولتر من ماء DEPC.
استخدم مجموعة عزل الحمض النووي الريبي لفصل الحمض النووي الريبي عن نيوكليوتيدات البروموريدين ثلاثي الفوسفات غير المدمجة وتخلص الحمض النووي الريبي من العمود ب 100 ميكرولتر من الماء الخالي من الحمض النووي الريبي. احتضان الحمض النووي الريبي في حمام مائي 65 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. ثم انقله إلى الثلج لمدة دقيقتين على الأقل.
ابدأ هذا الإجراء بإعداد حبات DU المضادة للبرومو أثناء ترسيب الحمض النووي الريبي. لكل عينة ، أضف 500 ميكرولتر من 0.25 × فوسفات الصوديوم الملحي EDTA إلى 25 ميكرولتر من الخرز المستقر. جهاز طرد مركزي عند 200 مرة G لمدة 30 ثانية عند أربع درجات مئوية ، وقم بإزالة المادة الطافية.
اغسل الخرزات ثلاث مرات باستخدام المخزن المؤقت الملزم. بعد إزالة المادة الطافية من الغسيل الثالث ، أضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت المانع إلى الخرزات ورجه برفق لمدة ساعة إلى ساعتين عند أربع درجات مئوية على شاكر المنصة. اغسل الخرزات مرتين أخريين باستخدام 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت الملزم.
قم بإزالة المادة الطافية من الغسيل الثاني وأضف 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت الملزم إلى الخرز. انقل 100 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي مباشرة إلى الخرز. احتضن مع الرج اللطيف لمدة ساعة إلى ساعتين عند أربع درجات مئوية على شاكر المنصة.
قم بالدوران عند 200 مرة جم لمدة 30 ثانية عند أربع درجات مئوية ثم قم بإزالة المادة الطافية. بعد ذلك ، أضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت الملزم إلى الخرز. قم بالدوران عند 200 مرة G لمدة 30 ثانية عند أربع درجات مئوية وقم بإزالة المادة الطافية.
بهذه الطريقة ، اغسل الخرزات بالتتابع باستخدام مخزن مؤقت ملزم ، ومخزن مؤقت منخفض للملح ، ومخزن مؤقت عالي الملح ، ومرتين باستخدام مخزن مؤقت TET. لتصفية البروموريدين ثلاثي الفوسفات المسمى الحمض النووي الريبي من الخرز ، أضف 150 ميكرولترا من محلول الشطف واحتضنه لمدة أربع دقائق عند 42 درجة مئوية في حمام مائي. تدور لفترة وجيزة واجمع المادة الطافية.
بهذه الطريقة ، قم بشطف بالتسلسل مرتين ب 150 ميكرولتر ومرة واحدة ب 200 ميكرولتر من محلول الشطف. يجب الحصول على حوالي 500 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي البروموريدين ثلاثي الفوسفات المنقى من كل عينة. لترسيب التقارب ، تقارب البروموريدين ثلاثي الفوسفات المنقى المسمى الحمض النووي الريبي ، أضف 500 ميكرولتر من كحول الفينول الكلوروفورم الأيزواميل البارد إلى كل عينة.
دوامة وجهاز طرد مركزي عند 16 ، 168 مرة G لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية. نقل المرحلة المائية العلوية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد. أضف الحجم المناسب لمخزون كلوريد الصوديوم بخمسة مولات للحصول على تركيز نهائي قدره 0.3 مولار.
ثم أضف ثلاثة أضعاف حجم الإيثانول البارد. احتضان عند 20 درجة مئوية بين عشية وضحاها لترسيب الحمض النووي الريبي. في اليوم التالي ، اجمع الحمض النووي الريبي المترسب عن طريق الطرد المركزي عند 16 ، 168 مرة G لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية.
قم بإزالة المادة الطافية واترك اللوحة تجف في الهواء لمدة 10 دقائق. أعد تعليق لوحة الحمض النووي الريبي في 26 ميكرولتر من ماء DEPC. حدد تركيز الحمض النووي الريبي النهائي عن طريق قياس الامتصاص عند 260 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي.
قم بتخزين عينات الحمض النووي الريبي وحصصها عند 80 درجة مئوية لحين الحاجة إليها لتخليق (كدنا). تم استخدام النسخ المحدد لخيط البروموريدين ثلاثي الفوسفات الذي يتم تشغيله على النهج لاختبار متطلبات الحمض النووي الريبي 14 لإنهاء نسخ جين ASC1 في الخميرة الناشئة. تم تنقية الحمض النووي الريبي ثلاثي الفوسفات المسمى بروموريدين من الحمض النووي الريبي 14-1 المتحولة وخلاياه البرية متساوية التكوين ونسخها العكسي باستخدام البادئات C و D و E و F و G. تم تضخيم (كدنا) المقابل باستخدام أزواج التمهيدي B و C و B و D و B و E و B و G ، وتم تجزئتها على المواد الهلامية الاغاروز.
يعكس وجود منتجات مكبرة PCR مضخمة من أزواج التمهيدي B و E و B و F و B و G في الطفرة ، نمطا ظاهريا لقراءة الإنهاء. ومع ذلك ، في الخلايا البرية ، كان تشغيل النسخ على الإشارة محدودا حتى عنصر المنهي ولم يكن هناك نسخ يمكن اكتشافه على إشارة خارج منطقة المنهي. يوضح هذا الرسم البياني القياس الكمي للمواد الهلامية بخمسة S RNA كعنصر تحكم في التطبيع.
يؤكد اكتشاف النصوص الناشئة التي بدأت المروج والتي تقرأ إشارة الإنهاء في الخلايا الطافرة ولكن ليس في الخلايا البرية أن الحمض النووي الريبي 14 هو عامل إنهاء. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في ثلاثة أيام. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن تشغيل النسخ عند التفاعل أمر بالغ الأهمية للحصول على نتيجة ناجحة.
باتباع هذا الإجراء ، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل البحث عن GRO من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل الدور الواسع للجينوم لعامل في الإنهاء. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال النسخ لاستكشاف الإنهاء بواسطة بوليميرات الحمض النووي الريبي الأخرى في الخميرة وأنظمة حقيقية النواة العليا. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء النسخ ، والتشغيل على التفاعلات وتنقية النصوص الناشئة.
لا تنس أن الحمض النووي الريبي يمكن أن يكون غير مستقر للغاية ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء القفازات والحفاظ على درجة الحرارة حوالي أربع درجات مئوية واستخدام العوامل الحرة من RNAse أثناء تنفيذ هذا الإجراء.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تصف هذه المقالة طريقة لتحليل إنهاء النسخ بواسطة بوليميراز الحمض النووي الريبي الثاني في الجسم الحي باستخدام BrUTP ونهج تشغيل النسخ المحدد للشريحة في الخميرة البادئة. يمكن أيضًا تعديل البروتوكول لدراسة إنهاء النسخ بواسطة بوليميرازات الحمض النووي الريبي الأخرى في كل من الخميرة والكائنات حقيقية النوى العليا.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- التنظيم النسخي
- نشاط بوليميراز الحمض النووي الريبي
- بيولوجيا الجزيئات في الخميرة
الخلفية
- إنهاء النسخ هو عملية حاسمة في التعبير الجيني.
- يسمح نهج تشغيل النسخ المحدد للشريحة بتحليل ديناميكيات النسخ.
- يمكن لهذه الطريقة التمييز بين أنواع مختلفة من بوليميرازات الحمض النووي الريبي.
- فهم عوامل الإنهاء ضروري لتوضيح دورة النسخ في الخميرة.
غرض الدراسة
- للتحقيق في إنهاء النسخ بواسطة بوليميراز الحمض النووي الريبي الثاني في الجسم الحي.
- لتحديد ما إذا كانت البوليميرازات النشطة نسخيًا تبدأ من منطقة المروج.
- لتوسيع النتائج لتشمل بوليميرازات الحمض النووي الريبي الأخرى في كائنات مختلفة.
الطرق المستخدمة
- نهج تشغيل النسخ المحدد للشريحة (TRO).
- استخدام BrUTP لتسمية نسخ الحمض النووي الريبي الناشئة.
- تقنيات تسلل الخلايا لتحليل النسخ الفعال.
- طرق تنقية النصوص الناشئة.
النتائج الرئيسية
- نجحت الطريقة في التمييز بين البوليميرازات المنسوخة للحمض النووي الريبي المرسال والبوليميرازات المنسوخة على نطاق واسع.
- تم الحصول على رؤى حول دور عوامل الإنهاء في دورة النسخ.
- يمكن تعديل النهج لاستخدامه في الكائنات حقيقية النوى العليا.
- تم تحديد التحديات في التنفيذ، مثل تسلل الخلايا، للمستخدمين الجدد.
الاستنتاجات
- نهج TRO المحدد للشريحة فعال لدراسة إنهاء النسخ.
- يمكن أن يوفر فهم إنهاء النسخ رؤى حول تنظيم الجينات.
- تتمتع هذه الطريقة بتطبيقات واسعة عبر الأنواع المختلفة.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
This method enables precise detection of transcription termination defects in vivo, addressing a key challenge in target validation where distinguishing true promoter-initiated readthrough from pervasive transcription is essential for mechanistic de-risking. By providing strand-specific, quantitative readouts of polymerase activity beyond terminator regions, it supports predictive confidence in early discovery stages focused on RNA polymerase II and termination factor biology. The approach offers translational continuity from yeast models to higher eukaryotes, facilitating cross-species target validation and preclinical pathway analysis.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by determining whether observed transcription readthrough stems from promoter-initiated polymerase activity rather than non-specific initiation.
- Operational Value: Enables functional validation of termination factors as drug targets by isolating their specific role in the transcription cycle.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by providing mechanistic evidence that reduces ambiguity in target engagement and pathway modulation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces strand-specific nascent RNA signals that serve as quantitative readouts for screening compounds or genetic perturbations affecting termination.
- Operational Value: Generates reproducible, affinity-purified BrUTP-labeled RNA suitable for downstream qPCR or sequencing applications in assay development pipelines.
- Scalability: The protocol’s reliance on standardized permeabilization and purification steps enables adaptation to multi-well formats for medium-throughput screening.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Connects termination mechanism studies in yeast to conserved pathways in higher eukaryotes, supporting translational biomarker alignment.
- Preclinical Continuity: Enables risk-adjusted advancement decisions by validating target function across model systems before moving to mammalian validation.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed phenotypes are due to specific termination factor loss versus pervasive transcriptional noise, improving target confidence.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target hypothesis testing through lead identification, particularly when termination mechanisms are under investigation, and supports handoff to preclinical teams via standardized, quantifiable outputs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by distinguishing promoter-driven transcription from background noise, aiding in pathway clarification and target de-risking.
- Screening: Delivers assay-ready, strand-specific nascent RNA that enables reliable comparison of genetic or pharmacological conditions affecting termination efficiency.
- Analytics: Provides amplifiable cDNA from purified BrUTP-labeled RNA, enabling quantitative PCR or sequencing readouts that help teams compare termination proficiency across conditions.
- Translational Research: Connects yeast-based termination findings to higher eukaryotes through conserved polymerase mechanisms, supporting preclinical continuity only when cross-species conservation is demonstrated.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for termination analysis that can be applied across multiple targets and projects within nucleic acid-targeted discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in transcription termination studies through strand-specific discrimination.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization via defined permeabilization, labeling, and purification steps that minimize user-dependent variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by delivering target-specific mechanistic data, reducing late-stage biological risk in RNA-focused therapeutic programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of termination factor targets based on validated, quantitative evidence of functional relevance.
Implementation Considerations
- Requires expertise in yeast molecular biology, RNA handling, and nucleic acid purification techniques to manage unstable nascent transcripts.
- Dependent on access to BrUTP, RNA isolation reagents, phenol-chloroform workflows, and specialized beads for affinity purification of bromouridine-labeled RNA.
- Necessitates cross-team standardization between discovery biology and analytics groups to ensure consistent RNA yield, labeling efficiency, and cDNA synthesis quality.
- Adaptation to mammalian or higher eukaryotic systems may require optimization of permeabilization conditions and validation of BrUTP incorporation efficiency.
- Practical limitations include low yield of nascent transcripts and technical difficulty in RNA purification, which may affect scalability for high-throughput applications without automation support.
