وقت حل التأين electrospray الهيدروجين، الديوتيريوم تبادل الطيف الكتلي لدراسة بنية البروتين وديناميكية

تلعب المرونة التوافقية دورا مهما في وظيفة البروتين والهدف العام لقياس الطيف الكتلي لتبادل الهيدروجين وديوتيريوم بالتأين الكهربائي الذي تم حله بمرور الوقت هو استكشاف التغيرات الهيكلية السريعة التي تقود الوظيفة في البروتينات المرتبة والمضطربة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال البيولوجيا الهيكلية ، مثل فوهة تأكيدات البروتين العابرة ، وهذا ليس الحد الأدنى من التقنيات الكلاسيكية عالية الدقة مثل تخطيط التكيسات الكهربائية والرنين المغناطيسي النووي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن مراقبة التفاعلات على مقياس زمني بالمللي ثانية ، وهو أمر مهم لتوصيف حواف الحلقة ، ومولتينغلوبيالز ، والبروتينات المضطربة جوهريا.

تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى علاج الاضطرابات التنكسية العصبية. لأنها غالبا ما تنطوي على الخطأ أو تجميع مناطق البروتين المضطربة جوهريا. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة للبروتينات المنظمة الأسبوعية ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على أنظمة أخرى ، مثل الإنزيمات التي تخضع للدوران التحفيزي ، أو توصيف البروتين والبروتين والبروتين والليجان والتفاعلات.

لبدء هذا الإجراء ، قم بالليزر على لوحة من خلال قناة إدخال لإدخال الكواشف ، وغرفة غسيل الكلى الاحترافية وقناة الإخراج ، على كتلة PMM8 قياسية ، باستخدام آلة حفارة بالليزر. بعد ذلك ، قم بقص شعرية معدنية من الفولاذ المقاوم للصدأ بقياس 30 إلى قطعتين بحجم 10 سم باستخدام أداة دوارة للقرص المقطوع بسمك 164 بوصة. استخدم ورق الرمل لتنعيم نهاية الشعيرات الدموية ، والتي يمكن تسهيلها من خلال المشاهدة تحت المجهر الضوئي.

الآن ، قم بإذابة تلك الشعيرات الدموية في كتلة PMM8 المحفورة باستخدام مكواة متجولة. لبناء تدفق مستمر ، خلاط حركي تم حله بمرور الوقت ، أدخل شعيرات دموية زجاجية مدمجة بطول 40 سم في مقياس 28 ، فولاذ ، شعري معدني يبلغ طوله حوالي 15 سم. بعد ذلك ، قم بإنتاج شق بملليمترين ، باستخدام إعدادات آلة النقش بالليزر منخفضة الطاقة على أحد طرفي الشعيرات الدموية الزجاجية الداخلية وختم هذا الطرف من الشعيرات الدموية الزجاجية الداخلية.

هذه خطوة حاسمة تضمن خلطا متعامدا وفعالا للبروتين ، والذي يخرج من خلال الشق الذي يتحول إليه المشترك. المساحة الشعرية بين المليمترين بين الشق ونهاية الشعيرات الدموية هي المزيج والحجم. قم بإرفاق التركيبات وأكمام الأنابيب ذات الحجم المناسب وقم بدمج موصل T ، والذي سيتم استخدامه لتقديم التدعير.

بعد ذلك ، قم بمحاذاة الشعيرات الدموية الزجاجية الداخلية مع نهاية الشعيرات الدموية المعدنية التي يمكن تسهيلها عن طريق المشاهدة تحت المجهر الضوئي. ضع علامة على هذا على أنه موضع صفر ملليمتر. قم بتوصيل هذا الخلاط الحركي بأحد طرفي الخلط T.ثم قم بإرفاق شعيرات شعرية من زجاج السيليكا المنصهر بطول 40 سم بالطرف المقابل للخلاط الحركي على الخلط T.لتنشيط البيبسين ، قم بتعليق 20 ملليغرام من البيبسين من الغشاء المخاطي الغازي بورسينا في مليلتر واحد من المخزن المؤقت للتوصيل.

أضف 50 ملليغرام من السرعات الزراعية المنشطة من NHS إلى البروتينات المعلقة وقم بتدويرها برفق طوال الليل ، عند أربع درجات مئوية. في اليوم التالي ، قم بتدوير الخليط بمقدار ألف مرة G لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة لجمع الراتنج. ثم استنشق البروتيوس غير المقيد.

بعد ذلك ، احتضن agros في مليلتر واحد من المخزن المؤقت الممنع وقم بتدويره برفق في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. بعد جمع الراتنج وشفط المخزن المؤقت المانع ، احتضان بيبسين agguros بملليلتر واحد من خمسة بالمائة من حمض الأسيديك لمدة خمس دقائق. قم بتدوير الخليط عند 1 ، 000 مرة جم ، لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة ، لتجميع الراتنج ، ثم استنشاق الطبيعة الفائقة.

بعد تكرار الخطوات السابقة ، لمدة ثلاث غسلات ، قم بتخزين الخرزات في مليلتر واحد من حمض الأسيديك عند أربع درجات مئوية للاستخدام على المدى الطويل. لتجميع الجهاز ، املأ غرفة التحلل البروتيالي بملاط من حبات البيبسين agguros المنشطة في خمسة بالمائة من حمض الأسيديك باستخدام ملعقة معقمة. ضع منصة PMMA الصغيرة بين كتلتين فارغتين PMMA كغطاء لإغلاق الجهاز ، مبطنة بمطاط السيليكون لإنشاء ختم سائل محكم.

استخدم ألواح تثبيت معدنية لضغط إغلاق الجهاز. ثم قم بتوصيل الخلط T بمدخل الجهاز باستخدام التركيبات المناسبة. الآن يتدفق خمسة في المائة من حمض الأسيديك يعتقد أن الخط الحمضي بمعدل عشرة ميكرولتر في الدقيقة.

ثم قم بتدفق 50 ملم من حمض الأمونيا عبر خط البروتين بمعدل ميكرولتر واحد في الدقيقة. قم بإقران الجهاز بالواجهة الأمامية لوقت الرحلة الرباعي المعدل ، أو مطياف الكتلة Qtof ، باستخدام مرحلة معزولة وقابلة للتعديل لتحقيق ظروف الرش الكهربائي المثلى. بعد ضبط شروط ESI-MS ، احصل على طيف البيبسين فقط.

بعد ذلك ، أدخل 50 إلى 100 ميكرومولر من تاو ، أو بروتين فوسفو تاو بمعدل ميكرولتر واحد في الدقيقة ، حيث كان المخزن المؤقت أسيتات الأمونيوم 50 ملم يتدفق سابقا. بعد السماح للنظام بالتوازن لمدة 10 دقائق على الأقل ، قبل الاستحواذ ، اكتساب الطيف البروتيني فقط. أثناء تدفق بروتين تاو أو فوسفو تاو ، أدخل أكسيد الدوتريوم بمعدل ثلاثة ميكرولتر في الدقيقة ، عبر موصل T ، واتركه يتفاعل في الخلاط الحركي.

من أجل زيادة وقت وضع الملصقات ، اسحب موضع الشعيرات الدموية الزجاجية الداخلية يدويا لتحقيق أوقات خلط من 42 مللي ثانية إلى ثماني ثوان ، مما يسمح للنظام بالتوازن لمدة 10 ثوان على الأقل بين كل تراجع. تصور هذه الرسوم المتحركة سير العمل لتجربة نموذجية. يخرج البروتين من خلال الشق ويختلط مع الدوتيريوم القادم.

يتم تبادل هيدروجينات العمود الفقري M8 خلال وقت التفاعل المخصص ، والذي يمكن أن يتغير عن طريق سحب الشعيرات الدموية للبروتين. ثم يتم إخماد التفاعل ثم هضمه على منصة سائلة دقيقة تحتوي على إبرة ESI مخرجة. يحتوي الطيف الناتج على بروتين مهضوم.

يتم حساب النسبة المئوية لامتصاص الديوتيريوم للببتيدات الفردية ثم يتم تعيينها على بنية البروتين ثلاثية الأبعاد. كانت ملامح الهضم الأصلية والفوسفو تاو متشابهة ، مما أدى إلى تغطية تسلسل تبلغ 77.1 و 71.7 في المائة ، على التوالي ، وأفضل توزيعات النظائر المناسبة وقيم امتصاص الديوتيريوم المرتبطة بها لأربعة ببتيدات بسيطة موضحة هنا. يتم استخدام المخطط الحركي المرصود بنسبة مئوية لامتصاص الديوتيريوم ، مقابل الوقت ، لكل ببتيد لاستخراج المعدل التجريبي المرصود.

يتم عرض ملفات تعريف الجودة العشوائية المحسوبة للمقارنة وتستخدم لاستخراج الدرجة الجوهرية النظرية. كما هو متوقع ، لم يتم ملاحظة أي عوامل حماية في النطاق ، والتي ترتبط عادة بعناصر الهيكل الثانوية ، مما يؤكد أن تاو الأصلي يظهر رابطة هيدروجينية داخلية ضعيفة. لوحظت حماية كبيرة في محطتي N و C ، والمجال المركزي ، ومناطق التجميع.

في تاو المرتبط بفرط الفوسفو ، لوحظت زيادة عامة في امتصاص الديوتيريوم عبر البروتين. وهناك زيادات كبيرة في الطرفين N و C وفي المنطقة ثنائية من سداسي الببتيد. يتم تلوين درجة عوامل الحماية كمخطط قوس قزح ، كما هو موضح هنا.

بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في غضون ساعات قليلة ، إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم استخدام مناطق من درجة الحوسبة عالية الأداء ، أو أعلى ، لتقليل الملوثات لأنها يمكن أن تتداخل مع التحليل. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى ، مثل وضع العلامات التساهمية ، والربط الكيميائي المتقاطع ، والنمذجة الحسابية ، والدراسات الوثائقية من أجل مطابقة هياكل البروتين ثلاثية الأبعاد ، أو تأكيد مناطق تفاعل البروتين والبروتين ليجين.

بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال البيولوجيا الهيكلية ، لاستكشاف البروتينات والمجالات المضطربة جوهريا ، الأكثر شيوعا في الأمراض التنكسية النويرية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام تأين الرش الكهربائي الذي تم حله بالوقت ، وتبادل الديوتيريوم الهيدروجين ، وقياس الطيف الكتلي ، لدراسة بنية البروتين وديناميكياته.