التنميط التعبيري باستخدام المصفوفات الدقيقة
المصفوفات الدقيقة هي أدوات مهمة لتنميط التعبير الجيني ، وتستند إلى الارتباط التكميلي بين المجسات المتصلة برقائق الزجاج والأحماض النووية المشتقة من الع…
المصفوفات الدقيقة للحمض النووي هي أدوات مستخدمة على نطاق واسع لقياس التعبير عن العديد من الجينات المختلفة في وقت واحد. وهي تتكون من آلاف المجسات - كل منها يمثل جينا مختلفا - مثبتة على "رقائق" أو شرائح ، وتعتمد على التهجين التكميلي لتقييم التعبير الجيني في ظروف بيولوجية مختلفة.
سيغطي هذا الفيديو المبادئ الأساسية لتقنية المصفوفات الدقيقة ، وبروتوكول لتنميط التعبير الجيني باستخدام المصفوفات الدقيقة ، وبعض التطبيقات الحالية.
لنبدأ بمناقشة مبادئ التنميط الجيني وتقنية المصفوفات الدقيقة.
واحدة من أقدم الطرق التي تم تطويرها لتقييم التعبير الجيني في العينات البيولوجية هي النشاف الشمالي ، والذي يتضمن "التحقيق" بحثا عن جزيئات الحمض النووي الريبي المحددة المثبتة على الأغشية. تتعرف المجسات "العائمة الحرة" على تسلسلات الحمض النووي الريبي التكميلية في العينة ، وعادة ما يتم تصنيفها بجزيئات مشعة أو فلورية بحيث يمكن تصورها.
أدى التقدم في التصنيع الدقيق وتسلسل الجينوم والتقنيات الأخرى إلى تطوير الرقاقة الحيوية للمصفوفات الدقيقة. مثل البقع الشمالية ، تعتمد المصفوفات الدقيقة على مبدأ الارتباط التكميلي بين المسبار وتسلسل الحمض النووي العينة. على عكس الشماليين ، في المصفوفات الدقيقة ، فإن مجسات قليل النوكليوتيدات هي التي يتم تجميدها على شريحة زجاجية أو شريحة. يتم إنشاء العينات "العائمة الحرة" من الحمض النووي الريبي المعزول عن الخلايا أو الكائنات الحية ذات الأهمية ، والتي يتم نسخها عكسيا إلى الحمض النووي التكميلي أو "c"-DNA. يمكن تصنيف هذا إما مباشرة بجزيئات الفلورسنت ، أو يمكن تضخيم كمياتها بشكل أكبر عن طريق في في المختبر في cRNA. ثم يتم تهجين العينة إلى الشريحة. نظرا لأن المجسات على المصفوفات الدقيقة المصممة لتطبيقات مختلفة قد تكون إما "حسية" ، مما يعني أن تسلسلاتها في نفس اتجاه الحمض النووي الريبي المعبر عنه للكائن الحي ، أو "antisense" ، يجب على الباحثين التأكد من أن اتجاه الخيط للعينة مكمل لاتجاه المجسات.
يمكن بعد ذلك قياس ومعالجة بيانات شدة التألق "الخام" لكل نقطة خاصة بالجين على الرقاقة. يمكن إخضاع البيانات لمزيد من الاختبارات الإحصائية ، مثل اختبار الطالب t ، لتحديد ما إذا كانت إشارات التألق - وبالتالي مستويات التعبير - للجين ذي الأهمية تختلف اختلافا كبيرا بين نوعين من الخلايا أو الظروف التجريبية.
يمكن للباحثين أيضا استخدام هذه البيانات "لتجميع" الجينات أو تجميعها بناء على أنماط مماثلة من التعبير. على سبيل المثال ، عند مقارنة أنماط التعبير بين مجموعتين من الخلايا ، يمكن العثور على جينات معينة لإظهار تغييرات التعبير بكميات متساوية تقريبا في نفس الاتجاه ، وبالتالي سيتم تجميعها معا. يمكن للباحثين تصوير هذه العلاقات في نوع من مخطط الشجرة أو "مخطط الشجيرات" حيث تشير ارتفاعات وترتيبات "الفروع" إلى مدى تشابه أنماط التعبير الجيني - أو اختلافها. يمكن أن يوفر هذا النوع من التحليل نظرة ثاقبة لشبكات الجينات ، حيث قد تشارك الجينات "العنقودية" في نفس المسارات البيولوجية.
الآن بعد أن ناقشنا مبادئ منهجية المصفوفات الدقيقة ، دعنا نلقي نظرة على تجربة المصفوفة الدقيقة النموذجية.
لضمان جودة الحمض النووي الريبي المعزول ، يجب معالجة مساحات العمل والمعدات بمواد كيميائية تعطل RNases - الإنزيمات التي من شأنها أن تدمر الحمض النووي الريبي. ثم يتم عزل الحمض النووي الريبي من العينات ذات الأهمية وتنقيته ، ويتم تحديد تركيزه وسلامته من خلال القياس الطيفي.
يتم تحويل عينة الحمض النووي الريبي هذه إلى الحمض النووي الريبي (cDNA) ، ثم cRNA. بعد ذلك ، يتم تصنيف العينة بجزيئات الفلورسنت ومجزأة ، ويمكن التحقق من جودتها وكميتها مرة أخرى ، وفي ذلك الوقت يمكن أيضا تقييم مدى وضع العلامات الفلورية.
ثم يتم خلط الحمض النووي الريبي المسمى مع "محلول التهجين" قبل التحميل على مصفوفة دقيقة. لتسهيل التهجين الناجح ، يتم وضع "خلاط" على الشريحة لتشكيل "غرف تهجين". ثم يضاف مزيج التهجين ببطء إلى المصفوفة. يجب توخي الحذر لتجنب فقاعات الهواء ، لأنها يمكن أن تتداخل مع ارتباط العينة بمناطق معينة على المصفوفة الدقيقة ، وتؤدي إلى إشارة سلبية خاطئة. بمجرد إضافة العينة ، يتم تحضين الرقائق في درجة الحرارة المناسبة لمدة تصل إلى 24 ساعة.
بعد التهجين ، تتم إزالة الخلاط من الرقاقة ، ويتم غسل العينة غير المنضمة ، ويتم تجفيف المصفوفة تماما عن طريق الطرد المركزي في جهاز طرد مركزي متخصص يحمل المنزلقات. يتم إدخال الشريحة المجففة في ماسح ضوئي للمصفوفات الدقيقة ، ويتم ضبط الجهاز بحيث لا تكون الإشارات الأكثر سطوعا التي لوحظت على الشريحة مشبعة بشكل مفرط. ثم يتم مسح المصفوفة الدقيقة ضوئيا ، ويتم إنتاج صورة للشريحة بأكملها.
بمجرد مسح الشريحة ضوئيا ، يتم تحميل ملف الصورة في برنامج استخراج البيانات وتقييمه بحثا عن أي مخالفات في الإشارة. تخضع البيانات المستخرجة من صورة المصفوفة الدقيقة لعدد من التلاعبات الإحصائية ، بما في ذلك تحويل log2 ، والذي يسمح للباحثين بتصوير البيانات عدديا من حيث زيادة أو نقصان الطي في التعبير الجيني. بالإضافة إلى التطبيع ، الذي يفسر اختلافات الإشارة بين رقائق المصفوفات الدقيقة. يمكن بعد ذلك تحليل هذه البيانات المعالجة بشكل أكبر.
الآن بعد أن أوضحنا كيفية إجراء التنميط التعبيري باستخدام المصفوفات الدقيقة ، دعنا نلقي نظرة على كيفية استخدام المصفوفات الدقيقة في تجارب محددة.
غالبا ما يستخدم الباحثون المصفوفات الدقيقة لتقييم كيفية تغير التعبير الجيني خلال العملية البيولوجية ، مثل التمايز الخلوي. هنا ، قام العلماء بتقييم مستويات الحمض النووي الريبي الصغير ، وهي عبارة عن 22 نيوكليوتيد من الحمض النووي الريبي الصغير الذي يشارك في ضبط التعبير الجيني ، في ثلاثة أنواع من الخلايا البشرية تمثل مراحل مختلفة من نمو شبكية العين. من خلال مقارنة تعبير الحمض النووي الريبي الصغير بين هذه الخلايا ، تمكن الباحثون من تحديد الجينات التي يحتمل أن تكون متورطة في تمايز أنسجة الشبكية وتطورها.
يمكن أيضا استخدام المصفوفات الدقيقة لتقييم اختلافات التعبير بين الخلايا أو أنواع الأنسجة المختلفة. في هذه التجربة ، تم إنشاء نموذج القوارض لاضطراب ما بعد الصدمة ، أو اضطراب ما بعد الصدمة ، عن طريق تعريض الفئران للصدمات الكهربائية. تم جمع الخلايا العصبية من مناطق مختلفة من الدماغ وعزل الحمض النووي الريبي. ثم تم استخدام المصفوفات الدقيقة لتحديد التعبير التفاضلي للجينات المرتبطة بالميتوكوندريا في هذه الخلايا العصبية ، مما يوفر نظرة ثاقبة للآليات الجزيئية المعقدة وراء اضطراب ما بعد الصدمة.
أخيرا ، يقوم الباحثون أيضا بتطبيق المصفوفات الدقيقة لدراسات السرطان ، على أمل أن يتم تحديد المؤشرات الحيوية الجديدة للمرض. نتيجة للعدوى بالفيروسات طوال تطورنا ، تحتوي الجينومات البشرية على تسلسلات جينية فيروسية يشار إليها باسم "الفيروسات القهقرية الذاتية" أو ERVs ، والتي لا يزال بعضها يتم التعبير عنه بنشاط. هنا ، تمت مقارنة التعبير عن ERVs في أنسجة البروستاتا السرطانية والطبيعية باستخدام المصفوفات الدقيقة. سمحت هذه الطريقة للباحثين بتحديد العديد من ERVs التي تم تنظيمها في سرطان البروستاتا ، مما يجعلها مؤشرات حيوية محتملة يمكن استخدامها لتشخيص المرض.
لقد شاهدت للتو فيديو JoVE حول توصيف التعبير الجيني باستخدام المصفوفات الدقيقة. غطى هذا الفيديو المبادئ الأساسية لتقنية المصفوفات الدقيقة ، وبروتوكول توصيف التعبير ، وتطبيقات هذه التقنية. كما هو الحال دائما ، شكرا على المشاهدة!
تسجيل الدخول أو للوصول إلى المحتوى الكامل. تعرّف على المزيد حول وصول مؤسستك إلى محتوى JoVE هنا
المصفوفات الدقيقة للحمض النووي هي أدوات مستخدمة على نطاق واسع لقياس التعبير عن العديد من الجينات المختلفة في وقت واحد. وهي تتكون من آلاف المجسات - كل منها يمثل جينا مختلفا - مثبتة على "رقائق" أو شرائح ، وتعتمد على التهجين التكميلي لتقييم التعبير الجيني في ظروف بيولوجية مختلفة.
سيغطي هذا الفيديو المبادئ الأساسية لتقنية المصفوفات الدقيقة ، وبروتوكول لتنميط التعبير الجيني باستخدام المصفوفات الدقيقة ، وبعض التطبيقات الحالية.
لنبدأ بمناقشة مبادئ التنميط الجيني وتقنية المصفوفات الدقيقة.
واحدة من أقدم الطرق التي تم تطويرها لتقييم التعبير الجيني في العينات البيولوجية هي النشاف الشمالي ، والذي يتضمن "التحقيق" بحثا عن جزيئات الحمض النووي الريبي المحددة المثبتة على الأغشية. تتعرف المجسات "العائمة الحرة" على تسلسلات الحمض النووي الريبي التكميلية في العينة ، وعادة ما يتم تصنيفها بجزيئات مشعة أو فلورية بحيث يمكن تصورها.
أدى التقدم في التصنيع الدقيق وتسلسل الجينوم والتقنيات الأخرى إلى تطوير الرقاقة الحيوية للمصفوفات الدقيقة. مثل البقع الشمالية ، تعتمد المصفوفات الدقيقة على مبدأ الارتباط التكميلي بين المسبار وتسلسل الحمض النووي العينة. على عكس الشماليين ، في المصفوفات الدقيقة ، فإن مجسات قليل النوكليوتيدات هي التي يتم تجميدها على شريحة زجاجية أو شريحة. يتم إنشاء العينات "العائمة الحرة" من الحمض النووي الريبي المعزول عن الخلايا أو الكائنات الحية ذات الأهمية ، والتي يتم نسخها عكسيا إلى الحمض النووي التكميلي أو "c"-DNA. يمكن تصنيف هذا إما مباشرة بجزيئات الفلورسنت ، أو يمكن تضخيم كمياتها بشكل أكبر عن طريق في في المختبر في cRNA. ثم يتم تهجين العينة إلى الشريحة. نظرا لأن المجسات على المصفوفات الدقيقة المصممة لتطبيقات مختلفة قد تكون إما "حسية" ، مما يعني أن تسلسلاتها في نفس اتجاه الحمض النووي الريبي المعبر عنه للكائن الحي ، أو "antisense" ، يجب على الباحثين التأكد من أن اتجاه الخيط للعينة مكمل لاتجاه المجسات.
يمكن بعد ذلك قياس ومعالجة بيانات شدة التألق "الخام" لكل نقطة خاصة بالجين على الرقاقة. يمكن إخضاع البيانات لمزيد من الاختبارات الإحصائية ، مثل اختبار الطالب t ، لتحديد ما إذا كانت إشارات التألق - وبالتالي مستويات التعبير - للجين ذي الأهمية تختلف اختلافا كبيرا بين نوعين من الخلايا أو الظروف التجريبية.
يمكن للباحثين أيضا استخدام هذه البيانات "لتجميع" الجينات أو تجميعها بناء على أنماط مماثلة من التعبير. على سبيل المثال ، عند مقارنة أنماط التعبير بين مجموعتين من الخلايا ، يمكن العثور على جينات معينة لإظهار تغييرات التعبير بكميات متساوية تقريبا في نفس الاتجاه ، وبالتالي سيتم تجميعها معا. يمكن للباحثين تصوير هذه العلاقات في نوع من مخطط الشجرة أو "مخطط الشجيرات" حيث تشير ارتفاعات وترتيبات "الفروع" إلى مدى تشابه أنماط التعبير الجيني - أو اختلافها. يمكن أن يوفر هذا النوع من التحليل نظرة ثاقبة لشبكات الجينات ، حيث قد تشارك الجينات "العنقودية" في نفس المسارات البيولوجية.
الآن بعد أن ناقشنا مبادئ منهجية المصفوفات الدقيقة ، دعنا نلقي نظرة على تجربة المصفوفة الدقيقة النموذجية.
لضمان جودة الحمض النووي الريبي المعزول ، يجب معالجة مساحات العمل والمعدات بمواد كيميائية تعطل RNases - الإنزيمات التي من شأنها أن تدمر الحمض النووي الريبي. ثم يتم عزل الحمض النووي الريبي من العينات ذات الأهمية وتنقيته ، ويتم تحديد تركيزه وسلامته من خلال القياس الطيفي.
يتم تحويل عينة الحمض النووي الريبي هذه إلى الحمض النووي الريبي (cDNA) ، ثم cRNA. بعد ذلك ، يتم تصنيف العينة بجزيئات الفلورسنت ومجزأة ، ويمكن التحقق من جودتها وكميتها مرة أخرى ، وفي ذلك الوقت يمكن أيضا تقييم مدى وضع العلامات الفلورية.
ثم يتم خلط الحمض النووي الريبي المسمى مع "محلول التهجين" قبل التحميل على مصفوفة دقيقة. لتسهيل التهجين الناجح ، يتم وضع "خلاط" على الشريحة لتشكيل "غرف تهجين". ثم يضاف مزيج التهجين ببطء إلى المصفوفة. يجب توخي الحذر لتجنب فقاعات الهواء ، لأنها يمكن أن تتداخل مع ارتباط العينة بمناطق معينة على المصفوفة الدقيقة ، وتؤدي إلى إشارة سلبية خاطئة. بمجرد إضافة العينة ، يتم تحضين الرقائق في درجة الحرارة المناسبة لمدة تصل إلى 24 ساعة.
بعد التهجين ، تتم إزالة الخلاط من الرقاقة ، ويتم غسل العينة غير المنضمة ، ويتم تجفيف المصفوفة تماما عن طريق الطرد المركزي في جهاز طرد مركزي متخصص يحمل المنزلقات. يتم إدخال الشريحة المجففة في ماسح ضوئي للمصفوفات الدقيقة ، ويتم ضبط الجهاز بحيث لا تكون الإشارات الأكثر سطوعا التي لوحظت على الشريحة مشبعة بشكل مفرط. ثم يتم مسح المصفوفة الدقيقة ضوئيا ، ويتم إنتاج صورة للشريحة بأكملها.
بمجرد مسح الشريحة ضوئيا ، يتم تحميل ملف الصورة في برنامج استخراج البيانات وتقييمه بحثا عن أي مخالفات في الإشارة. تخضع البيانات المستخرجة من صورة المصفوفة الدقيقة لعدد من التلاعبات الإحصائية ، بما في ذلك تحويل log2 ، والذي يسمح للباحثين بتصوير البيانات عدديا من حيث زيادة أو نقصان الطي في التعبير الجيني. بالإضافة إلى التطبيع ، الذي يفسر اختلافات الإشارة بين رقائق المصفوفات الدقيقة. يمكن بعد ذلك تحليل هذه البيانات المعالجة بشكل أكبر.
الآن بعد أن أوضحنا كيفية إجراء التنميط التعبيري باستخدام المصفوفات الدقيقة ، دعنا نلقي نظرة على كيفية استخدام المصفوفات الدقيقة في تجارب محددة.
غالبا ما يستخدم الباحثون المصفوفات الدقيقة لتقييم كيفية تغير التعبير الجيني خلال العملية البيولوجية ، مثل التمايز الخلوي. هنا ، قام العلماء بتقييم مستويات الحمض النووي الريبي الصغير ، وهي عبارة عن 22 نيوكليوتيد من الحمض النووي الريبي الصغير الذي يشارك في ضبط التعبير الجيني ، في ثلاثة أنواع من الخلايا البشرية تمثل مراحل مختلفة من نمو شبكية العين. من خلال مقارنة تعبير الحمض النووي الريبي الصغير بين هذه الخلايا ، تمكن الباحثون من تحديد الجينات التي يحتمل أن تكون متورطة في تمايز أنسجة الشبكية وتطورها.
يمكن أيضا استخدام المصفوفات الدقيقة لتقييم اختلافات التعبير بين الخلايا أو أنواع الأنسجة المختلفة. في هذه التجربة ، تم إنشاء نموذج القوارض لاضطراب ما بعد الصدمة ، أو اضطراب ما بعد الصدمة ، عن طريق تعريض الفئران للصدمات الكهربائية. تم جمع الخلايا العصبية من مناطق مختلفة من الدماغ وعزل الحمض النووي الريبي. ثم تم استخدام المصفوفات الدقيقة لتحديد التعبير التفاضلي للجينات المرتبطة بالميتوكوندريا في هذه الخلايا العصبية ، مما يوفر نظرة ثاقبة للآليات الجزيئية المعقدة وراء اضطراب ما بعد الصدمة.
أخيرا ، يقوم الباحثون أيضا بتطبيق المصفوفات الدقيقة لدراسات السرطان ، على أمل أن يتم تحديد المؤشرات الحيوية الجديدة للمرض. نتيجة للعدوى بالفيروسات طوال تطورنا ، تحتوي الجينومات البشرية على تسلسلات جينية فيروسية يشار إليها باسم "الفيروسات القهقرية الذاتية" أو ERVs ، والتي لا يزال بعضها يتم التعبير عنه بنشاط. هنا ، تمت مقارنة التعبير عن ERVs في أنسجة البروستاتا السرطانية والطبيعية باستخدام المصفوفات الدقيقة. سمحت هذه الطريقة للباحثين بتحديد العديد من ERVs التي تم تنظيمها في سرطان البروستاتا ، مما يجعلها مؤشرات حيوية محتملة يمكن استخدامها لتشخيص المرض.
لقد شاهدت للتو فيديو JoVE حول توصيف التعبير الجيني باستخدام المصفوفات الدقيقة. غطى هذا الفيديو المبادئ الأساسية لتقنية المصفوفات الدقيقة ، وبروتوكول توصيف التعبير ، وتطبيقات هذه التقنية. كما هو الحال دائما ، شكرا على المشاهدة!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: How do microarrays measure gene expression?
Microarrays measure gene expression through complementary hybridization between immobilized probes on glass chips and labeled sample nucleic acids. RNA from cells is reverse transcribed to cDNA, then converted to cRNA and labeled with fluorescent molecules. When the labeled sample hybridizes to matching probes on the chip, fluorescence intensity at each spot indicates expression levels for thousands of genes simultaneously.
Q2: What is the difference between microarrays and Northern blotting?
Northern blotting uses free-floating probes to detect RNA immobilized on membranes, while microarrays reverse this arrangement. In microarrays, oligonucleotide probes are immobilized on glass slides, and free-floating labeled cDNA or cRNA samples hybridize to them. This allows microarrays to simultaneously evaluate thousands of genes, whereas Northern blots typically assess one or a few genes at a time.
Q3: Why is RNA quality important before microarray analysis?
RNA quality is critical because RNases—enzymes that degrade RNA—can destroy samples during isolation and preparation. Workspaces and equipment are treated with RNase-inactivating chemicals to protect RNA integrity. Researchers verify RNA quality and concentration through spectrophotometry before converting it to cDNA, ensuring reliable downstream hybridization and accurate gene expression measurements.
Q4: How does microarray data analysis reveal gene relationships?
Microarray data undergoes statistical processing including log2 transformation and normalization to account for signal differences between chips. Researchers then cluster genes based on similar expression patterns across conditions. Dendrograms depict these relationships, showing how closely gene expression patterns match. Clustered genes often participate in the same biological pathways, providing insight into gene networks and functional associations.
Q5: What role do hybridization chambers play in microarray experiments?
Hybridization chambers are formed by placing a mixer onto the microarray chip to create isolated compartments for the hybridization mix. These chambers facilitate controlled binding between labeled sample and immobilized probes. Care must be taken to avoid air bubbles during sample loading, as they interfere with binding and produce false negative signals. Chips are then incubated at appropriate temperatures for up to 24 hours.
Q6: How are microarrays applied to cancer research?
Researchers use microarrays to compare gene expression between cancerous and normal tissues to identify disease biomarkers. For example, scientists compared endogenous retroviruses (ERVs)—viral sequences in human genomes—between prostate cancer and normal tissues. This identified ERVs upregulated in cancer, which can serve as diagnostic biomarkers. Microarrays enable simultaneous evaluation of thousands of genes to pinpoint expression differences associated with disease.
Q7: What does microarray scanning and image processing reveal?
After hybridization, the dried microarray is scanned to produce a digital image showing fluorescence intensity at each probe location. The scanner is adjusted to prevent signal over-saturation. Data-extraction software then analyzes the image for signal irregularities and processes the data through log2 transformation and normalization. This processed data quantifies fold changes in gene expression between experimental conditions.