تحليل Transcriptomic من C. ايليجانس RNA تسلسل البيانات من خلال جناح سهرة على مشروع غالاكسي

الهدف العام لهذا البروتوكول هو مساعدة باحثي C.elegans الذين ليس لديهم خبرة في المعلوماتية الحيوية على إجراء تجربة تسلسل الحمض النووي الريبي وتحليل البيانات باستخدام منصة الوصول المفتوح Galaxy. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في تحليل بيانات التسلسل المعقدة من خلال وضع البيانات لتوفير رؤى حول التوقيعات النسخية وراء الأنماط الظاهرية في C.elegans. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تمكن العلماء الذين لم يتلقوا تدريبا مسبقا في المعلوماتية الحيوية من تحليل بيانات التسلسل الخام وإنتاج قائمة بالجينات المعبر عنها تفاضليا ، جنبا إلى جنب مع مصطلحات الأنطولوجيا الجينية المرتبطة بها.

على الرغم من أن هذه الطريقة موجهة بشكل خاص نحو الفروق الدقيقة في بيانات تسلسل C.elegans ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على الكائنات الحية الأخرى والسياق البيولوجي حيث تحتاج الجينومات إلى فحص تغييرات النسخ الرئيسية. يتعامل هذا الفيديو مع الاستخدام المستند إلى الويب لخط أنابيب Galaxy. إذا كان ذلك ممكنا، فقم بتشغيل تدفق العمل محليا.

قم بتنزيل وتثبيت Galaxy وفقا للتعليمات الموجودة على صفحة wiki. بعد استخدام البرنامج التعليمي Start here المقدم على صفحة Galaxy الرئيسية ، اتبع هذا الفيديو. من الأهمية بمكان للمستخدم أن يتعرف ويوجه نفسه بواجهة مستخدم Galaxy والأدوات المستخدمة في تدفق العمل.

للبدء ، انقر فوق تحليل البيانات في لوحة الرأس للوصول إلى طريقة عرض التحليل الرئيسية. يراقب شريط التقدم في الجزء العلوي الأيمن مقدار مساحة القرص التي تم استخدامها. بعد ذلك ، قم بالوصول إلى قائمة الأدوات في اللوحة اليسرى وانقر فوق تحليل NGS RNA.

يوفر هذا خيارات لاستخدام جميع الأدوات المطلوبة لتحليل بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي. الآن ، ابدأ محفوظات تحليل جديدة. انتقل إلى لوحة المحفوظات على اليمين.

انقر فوق رمز الترس واختر خيار إنشاء جديد من القائمة المنبثقة. بعد ذلك ، أدخل اسما ضمن التاريخ لتحديد التحليل. للمتابعة ، انتقل إلى قائمة الأدوات ، وضمن الحصول على البيانات ، انقر فوق وظيفة تحميل ملف لتحميل ملفات قائمة الانتظار السريعة الأولية.

بعد فتح المهمة في واجهة التحليل ، انقر فوق اختيار ملف محلي ، أو اختر ملف FTP للانتقال إلى بيانات التسلسل المناسبة وتحديدها. بشكل افتراضي ، سيكتشف Galaxy نوع الملف تلقائيا. ثم حدد الكائن الحي من القائمة المنسدلة والتي تكون في هذه الحالة C.elegans.

بعد ذلك ، انقر فوق ابدأ لبدء تحميل البيانات. بعد تحميل الملف، يتم حفظ الإجراء في لوحة المحفوظات التي يمكن تحديد البيانات منها والوصول إليها. الآن ، قم بتحويل الملفات من تنسيق قائمة الانتظار السريعة واحدة تلو الأخرى إلى تنسيق قائمة الانتظار السريع عن طريق الوصول إلى NGS QC وقائمة التلاعب ، وتحديد مربية قائمة الانتظار السريعة ، واختيار الملف الموجود أسفل الملف المراد العناية به.

حدد نوع درجات المساواة السريعة للإدخال المناسب وقم بتشغيل الأداة باستخدام المعلمات الافتراضية. يمكن الآن تحليل ملف البيانات. انتبه بشكل خاص لتنسيقات الملفات ومعلمات الاختبار المستخدمة في جميع أنحاء البروتوكول.

هذه المعرفة ذات قيمة لاستكشاف الاختبارات الفاشلة وغيرها من المشكلات وإصلاحها. يمكن استخدام اختبارات مراقبة الجودة قبل المتابعة. يتم توفير تفاصيل حول تشغيلها في بروتوكول النص.

بمجرد أن يصبح الملف جاهزا للتحليل ، قم بتعيين بيانات التسلسل عن طريق فتح قسم تحليل الحمض النووي الريبي NGS أولا ثم النقر فوق أداة القبعة العلوية. من القائمة المنسدلة ، املأ إجابة السؤال هل هذه البيانات النهائية الفردية أم المزدوجة؟ بعد ذلك ، اختر ملف قائمة الانتظار السريع المناسب.

حدد استخدام جينوم مدمج في القائمة المنسدلة التالية واختر بيانات الجينوم المرجعية C.elegans. حدد افتراضيا لكافة خيارات المعلمات الأخرى، ثم انقر فوق تنفيذ. لتقدير الوفرة النسبية للنصوص في مجموعة البيانات ، حدد أداة روابط الأكمام في قسم تحليل الحمض النووي الريبي NGS ومن القائمة المنسدلة الأولى ، اختر ملف تنسيق bam المقبولة المعينة التي تم الحصول عليها من تحليل القبعة العلوية.

من القائمة المنسدلة الثانية ، قم بتعيين التعليق التوضيحي المرجعي على ملف GTF الذي يحتوي على بيانات الجينوم الحالية. عند تقديم خيار إجراء تصحيح التحيز، حدد نعم وقم بتشغيل المهمة باستخدام الإعدادات الافتراضية. بعد ذلك ، من قائمة تحليل الحمض النووي الريبي NGS ، افتح أداة دمج الكفة لدمج النصوص المجمعة التي تم إنتاجها لجميع عينات تسلسل الحمض النووي الريبي.

يقوم المربع الأول في الأداة بتحميل جميع ملفات GTF التي تم إنتاجها باستخدام روابط الأكمام في الخطوة السابقة. الآن ، حدد ملف النصوص المجمعة لكل سلالة أو ظروف تم اختبارها بما في ذلك التكرارات البيولوجية لنفس حالة الإجهاد. حدد نعم للتعليق التوضيحي المرجعي للمستخدم، واختر ملف بيانات الجينوم المرجعي.

بعد ذلك ، حدد نعم لخيار استخدام بيانات التسلسل. سيؤدي هذا تلقائيا إلى اكتشاف واختيار الجينوم المرجعي المناسب. اترك جميع المعلمات الأخرى في إعدادها الافتراضي وانقر فوق تنفيذ.

سيتم إنتاج ملف GTF واحد. لمقارنة سلالات أو ظروف متعددة ، ارجع إلى قسم تحليل الحمض النووي الريبي NGS وحدد أداة cuff div. ثم من قائمة النصوص في أداة cuff div ، حدد ملف الإخراج المدمج من دمج الكفة.

ثم أدخل تسميات للشرطين. لكل شرط، انتقل إلى النسخ المتماثلة وحدد النتائج الفردية المقبولة وملفات إخراج النتائج من القبعة العلوية التي تتوافق مع التكرارات البيولوجية المختلفة لتلك الحالة. لتحديد ملفات متعددة في وقت واحد، اضغط باستمرار على الأمر أو مفتاح التحكم.

بعد تحديد الملفات ، استخدم إعدادات المعلمة الافتراضية وانقر فوق تنفيذ لتشغيل المهمة. قم بتنزيل البيانات المعبر عنها بشكل تفاضلي بالنقر فوق أيقونة الحفظ في مربع الاختبار التفاضلي الجيني الذي تم إنشاؤه في لوحة المحفوظات. للبدء ، قم بالوصول إلى ديفيد من الموقع.

من رأس صفحة الويب، اختر بدء التحليل. انسخ قائمة الجينات التي تم الحصول عليها من Galaxy إلى المربع A وفي هذا المثال حدد معرف الجين كمعرف الجين الأساسي للدودة ، ثم ضمن نوع القائمة في السؤال الثالث ، اختر قائمة الجينات وانقر على أيقونة قائمة الإرسال. الآن سيتم فتح الصفحة الرئيسية لمعالج التحليل التي يمكن من خلالها تحديد مهام ديفيد.

يصف مقطع الفيديو هذا بعضا من هذه الخيارات. أولا، اختر تجميع التعليقات التوضيحية الوظيفية للانتقال إلى صفحة الملخص. اترك فئات التعليقات التوضيحية في إعداداتها الافتراضية وانقر فوق تجميع التعليقات التوضيحية الوظيفية.

ينشئ هذا الخيار مجموعات من مصطلحات التعليقات التوضيحية المتشابهة مرتبة حسب درجة الإثراء الخاصة بها. الآن ، ارجع إلى معالج التحليل ، وحدد خيار مخطط التعليقات التوضيحية الوظيفية لتحديد المصطلحات البيولوجية الممثلة تمثيلا بشكل كبير المرتبطة بقائمة الجينات. ميزة ديفيد القيمة هي خيار إنشاء جدول تعليقات توضيحية وظيفي.

يسرد هذا جميع التعليقات التوضيحية المرتبطة بالجينات دون إظهار أي حسابات إحصائية. يمكن أن يكون هذا مفيدا للجينات عن طريق التحليل الجيني وللعثور على جينات محددة ذات أهمية. أداة أخرى مفيدة لديفيد للمراجعة هي التصنيف الوظيفي الجيني.

يفصل هذا الخيار الجينات في قائمة المجموعات ذات الصلة وظيفيا مرتبة حسب درجة التخصيب الخاصة بها. تم استخدام البروتوكول الموصوف لتحديد الجينات التي يتم تعديل تعبيرها بواسطة tcer-1 بعد فقدان الخط الجرثومي. تمت مقارنة نسخ طفرات قائمة الخط الجرثومي طويل العمر glp-1 مع الطفرات المزدوجة tcer-1 glp-1 التي تسرد الخط الجرثومي لدينا ولكنها لا تظهر تمديد العمر.

يجد فحص جودة التسلسلات أي قراءات ذات جودة رديئة ، ومحتوى GC من 48 إلى 49٪ ، وطول قراءة تسلسل ثابت يبلغ 51 زوجا أساسيا. قدرت تغطية الجينوم للعينات بما يتراوح بين سبعة أضعاف و 11 ضعفا. أتاح Galaxy الجمع بين بيانات NGS من النسختين المتماثلين لكل سلالة وإجراء تحليل تفاضلي لإنشاء قوائم جينات تسلط الضوء على ملف تعريف التعبير الواسع للجينوم.

بشكل عام ، تم التعبير عن 835 جينا بشكل تفاضلي بين السلالتين باستخدام قيمة P مقطوعة من 0.05. كشف تحليل التعليقات التوضيحية الوظيفية للجينات المنظمة أعلاه عن أربع مجموعات تعليق توضيحي ذات درجات تخصيب عالية. أعلى بما في ذلك السيتوكروم P450 وجينات الاستجابة الغريبة الحيوية ، تليها الجينات المتورطة في تعديلات الدهون.

حددت مجموعة التعليقات التوضيحية الوظيفية للأهداف المنظمة لأسفل مجموعة متنوعة من مجموعات التعليقات التوضيحية. وشملت هذه المجموعات المخصبة لوظيفة الهيكل الخلوي ، والتنظيم الإيجابي للنمو والتكاثر والشيخوخة. مهد خط أنابيب Galaxy الطريق للباحثين في مجموعة واسعة من التخصصات البيولوجية ، لتحليل تغيرات التعبير الجيني على نطاق واسع بسرعة وكفاءة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن تكون قادرا على إجراء تجربة بحث الحمض النووي الريبي ، وتحليل الارتفاع الخام من خلال بيانات التسلسل باستخدام خط أنابيب Galaxy. يجب أن تكون قادرا أيضا على استخراج المعلومات ذات الصلة بيولوجيا من بيانات Galaxy باستخدام منصة David.