What is RNA-seq and how does it differ from microarrays?

RNA-seq is a high-throughput sequencing technique that measures the sequence and quantity of all RNA expressed in a cell population, called the transcriptome. Unlike microarrays, which probe for known RNA sequences, RNA-seq can profile gene expression from organisms with unsequenced genomes and accurately measure a larger range of transcript expression levels, especially at very low or very high levels.

Why is rRNA removed before RNA-seq library preparation?

Most RNA in cells is ribosomal RNA (rRNA), which is the central component of the cell's protein-production machinery. Removing rRNA facilitates recovery of other transcript types for accurate measurement. rRNA is typically removed by hybridizing the sample to complementary oligonucleotides attached to magnetic beads, then using a magnet to separate rRNA from the rest of the sample.

How are RNA samples converted to DNA for sequencing?

Because RNA is inherently prone to degradation, it is first reverse transcribed to double-stranded DNA. Oligonucleotide sequences called adaptors are then ligated onto the DNA fragments. These adaptors contain constant regions that serve as primer-binding sites for PCR amplification and unique sequences called barcodes that identify fragments from each sample.

What role do barcodes play in RNA-seq library preparation?

Barcodes are unique oligonucleotide sequences contained within adaptors that identify all DNA fragments originating from a single sample. This allows libraries from different samples to be mixed together and sequenced simultaneously. After sequencing, the barcodes enable researchers to sort and analyze reads by their source sample.

How is RNA-seq data quality assessed during sequencing?

The quality of sequencing is indicated by the Q score, which reflects the likelihood of an incorrect base being identified. Q scores greater than 30 correspond to less than a 1 in 1,000 chance of an incorrect read. Additionally, reference DNA sequences added at low concentration serve as quality control, and their recovery at the expected rate indicates that all library sequences are evenly represented.

What can RNA-seq reveal about gene expression differences between samples?

RNA-seq can identify genes that are differentially expressed under different conditions by comparing transcriptomes between samples. Researchers can count the number of reads per transcript to measure RNA abundance. Even for organisms without sequenced genomes, transcriptome information can be compared to other sequenced species to identify genes with increased or decreased expression levels.

How is RNA-seq used to study RNA-protein interactions?

RNA-seq can be adapted to identify transcripts that a protein of interest binds to by immunoprecipitating the protein with antibodies and defining the bound RNAs through sequencing. When RNA-protein complexes are crosslinked at the beginning, sequencing analysis can map the crosslink site and identify the protein-binding site on the RNA down to the nucleotide level.

الحمض النووي الريبي Seq

0 مشاهدة09:54 دقيقة

تسلسل الحمض النووي الريبي ، أو تسلسل الحمض النووي الريبي ، هو تقنية يمكن أن توفر معلومات عن تسلسل وكمية كل RNA يتم التعبير عنه ، والمعروف باسم "النسخ" ، في مجموعة من الخلايا. على عكس طرق تحديد ملامح التعبير الأخرى مثل المصفوفات الدقيقة ، والتي تتضمن التحقيق في تسلسلات الحمض النووي الريبي المعروفة ، يمكن ل RNA-seq تحديد التعبير الجيني من الكائنات الحية ذات الجينومات غير المتسلسلة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يقيس تسلسل الحمض النووي الريبي بدقة نطاقا أكبر من مستويات التعبير عن النسخ مقارنة بالمصفوفات الدقيقة ، خاصة عند المستويات المنخفضة جدا أو العالية جدا.

سيغطي هذا الفيديو مبادئ RNA-seq ، وهو بروتوكول لإعداد مكتبة RNA-seq وتحليل البيانات ، وبعض تطبيقات هذه التقنية.

أولا ، دعنا نراجع بعض المبادئ الكامنة وراء تسلسل الحمض النووي الريبي. يتطلب تسلسل النسخ عزل مجموعة من النصوص التي سيتم قياس مستوياتها. معظم الحمض النووي الريبي في الخلايا هو الحمض النووي الريبي الريبوسومي ، أو الرنا المرسال ، المكون المركزي لآلية إنتاج البروتين في الخلية. لتسهيل استعادة أنواع أخرى من النصوص ، تتم إزالة الرنا الريبي عادة قبل التسلسل عن طريق تهجين العينة إلى قليل النوكليوتيدات التكميلية المتصلة بالخرز المغناطيسي ، واستخدام مغناطيس لفصل الحمض النووي الريبي عن بقية العينة.

بدلا من ذلك ، يمكن اختيار مجموعة معينة من الحمض النووي الريبي للتسلسل. على سبيل المثال ، يمكن التقاط الحمض النووي الريبي المرسال المشفر للبروتين ، أو mRNAs ، باستخدام "oligo-dT" - امتدادات قصيرة من نيوكليوتيدات deoxy-T التي ترتبط بتسلسل قواعد A المعروفة باسم ذيل poly-A في نهاية هذه النصوص. ثم تتم إزالة الحمض النووي الريبي الملوث. يمكن عزل MicroRNAs ، وهي RNAs تنظيمية مكونة من 22 نيوكليوتيدات ، بشكل انتقائي للتسلسل بناء على حجمها. نظرا لأن الحمض النووي الريبي عرضة بطبيعته للتدهور ، يتم نسخه أولا إلى الحمض النووي مزدوج الشريطة.

ثم يتم ربط تسلسلات قليل النوكليوتيدات المعروفة باسم المحولات على شظايا الحمض النووي. تحتوي المحولات على مناطق ثابتة تعمل كمواقع ربط أولية لتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل اللاحق ، وعادة ما تكون غير متماثلة بحيث يتم الحفاظ على "تقطعت بهم السبل" في القالب. تحتوي المحولات أيضا على تسلسلات فريدة ، تعرف باسم "الرموز الشريطية" ، والتي تحدد جميع الأجزاء التي تنشأ من عينة واحدة. ثم يتم تضخيم المكتبة بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).

يتم استخدام شريحة التسلسل ، التي توجد عليها قليل النوكليوتيدات المكملة للمحولات ، لشل حركة عينة المكتبة ، والتي يتم تخفيفها بحيث تلدين جزيئات الحمض النووي على الرقاقة بكثافة منخفضة. يتم تضخيم الحمض النووي على الرقاقة عبر عملية تسمى "تضخيم الجسر" لتشكيل "مجموعات نسيلية". يتم بعد ذلك تصنيع الأجزاء القصيرة ، كل منها يتراوح طولها بين 30 و 150 قاعدة ، من أحد طرفي قوالب الحمض النووي هذه أو كلاهما ، مما ينتج عنه مئات الملايين من المنتجات المعروفة باسم قراءات التسلسل.

ثم يتم تحليل نتائج التسلسل للتأكد من جودتها ومعالجة البيانات. يمكن أن يكشف تحليل التسلسلات عن مجموعة متنوعة من المعلومات ، بما في ذلك الاختلافات في مستويات التعبير عن الحمض النووي الريبي بين العينات والنصوص أو أشكال النصوص غير المعروفة سابقا.

الآن بعد أن رأينا كيف يعمل تسلسل الحمض النووي الريبي ، دعنا ننتقل إلى بروتوكول لإعداد مكتبة تسلسل الحمض النووي الريبي وتحليل بيانات التسلسل. يتم الحصول على الحمض النووي الريبي أولا من العينة محل الاهتمام ، ويتم فحص جودته عن طريق الرحلان الكهربائي ، على سبيل المثال باستخدام جهاز موائع دقيقة يسمى المحلل الحيوي. يجب أن يكون الحمض النووي الريبي عالي الجودة للحصول على نتائج تسلسل دقيقة. لضمان عدم وجود تلوث بالحمض النووي ، يتم إجراء RT-PCR للجين المعبر عنه مع أو بدون نسخ عكسي. يجب ألا تكون هناك منتجات في حالة عدم وجود نسخ عكسي.

لتحديد poly-A RNA ، ترتبط العينات بمجسات oligo-dT متصلة بالخرز المغناطيسي. يتم تجزئة الحمض النووي الريبي المختار إلى 200 قطعة نيوكليوتيدات عند درجة حرارة عالية في وجود أيونات المغنيسيوم ، مما يقلل من التحيزات المعتمدة على الطول في التفاعلات والتحليلات اللاحقة. ثم يتم تحويل الأجزاء إلى حمض نووي مزدوج الشريطة ، ويتم ربط المحولات. يتم تضخيم المكتبة بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل ، ويتم فحص جودتها على محلل حيوي وإجراء qPCR. يجب أن تكشف نتائج المحلل الحيوي عن ذروة المنتجات بالحجم المتوقع بناء على متوسط حجم الجزء وطول المحولات.

يمكن خلط المكتبات من عينات مختلفة ، تحتوي على محولات شريطية مختلفة ، معا ، جنبا إلى جنب مع عينة من الحمض النووي المرجعي المضافة بتركيز منخفض كمراقبة جودة للخطوات اللاحقة للعملية ، مثل توليد الكتلة النسيلة وتفاعلات التسلسل. يضاف الخليط إلى شريحة التسلسل وتحميله في الماكينة.

أثناء تفاعل التسلسل ، تتم مراقبة كثافة مجموعات الحمض النووي: يجب ألا تكون عالية جدا ، مما قد يؤدي إلى تلوث متبادل ، أو منخفض جدا ، مما قد يؤدي إلى عدم كفاية البيانات. يتم إعطاء جودة التسلسل من خلال درجة Q ، مما يشير إلى احتمالية تحديد قاعدة غير صحيحة. يجب أن تكون درجات Q لمعظم القواعد أكبر من 30 ، وهو ما يتوافق مع فرصة أقل من 1 في 1000 لقراءة غير صحيحة. يشير استرداد تسلسلات الحمض النووي المرجعي بالمعدل المتوقع إلى أن جميع تسلسلات المكتبة ممثلة بالتساوي.

ثم تتداخل القراءات الناتجة عن التسلسل مع بعضها البعض لاستنتاج الحمض النووي الريبي الذي تم تسلسله. بالنسبة للكائنات الحية التي تتوفر فيها معلومات الجينوم ، يمكن محاذاة القراءات مع الجينوم المرجعي. يتم حساب عدد القراءات لكل نسخة لقياس وفرة كل RNA.

بعد رؤية كيفية عمل تسلسل الحمض النووي الريبي ، دعنا نلقي نظرة على بعض طرق استخدامه.

يمكن أن يحدد تسلسل النسخ الجينات التي يتم التعبير عنها بشكل تفاضلي في ظل ظروف مختلفة. على سبيل المثال ، في هذه التجربة ، تمت مقارنة نسخ يرقات البعوض المنتجة في ظل ظروف نمو مختلفة. على الرغم من أن هذا النوع المعين من البعوض الحامل للأمراض لا يحتوي على جينوم متسلسل ، إلا أن الباحثين تمكنوا من مقارنة معلومات النسخ التي تم الحصول عليها بالأنواع المتسلسلة الأخرى ، وتحديد الجينات ذات مستويات التعبير المتزايدة أو المنخفضة.

يمكن أيضا استخدام تسلسل الحمض النووي الريبي في "فحوصات المراسلين المتوازية على نطاق واسع" لدراسة آليات تنظيم الجينات. يتم ذلك عن طريق نقل خلايا الثدييات بمكتبة تضم آلاف البلازميدات ، كل منها يحتوي على متغير متحور لموقع تنظيمي جيني "يقود" نسخ تسلسل مراسل مقترن بعلامات فريدة. بعد عزل الحمض النووي الريبي وتسلسل عالي الإنتاجية ، يتم تقييم مستويات كل علامة لتقييم تعبير المراسل من كل بناء ، مما يعطي نظرة ثاقبة للأهمية الوظيفية للنيوكليوتيدات المتحولة في كل متغير موقع تنظيمي.

أخيرا ، يمكن تكييف تسلسل الحمض النووي الريبي لدراسة تفاعلات الحمض النووي الريبي والبروتين ، لا سيما لتحديد النصوص التي يرتبط بها البروتين ذي الأهمية. يتم ترسيب البروتين مناعيا بالأجسام المضادة ويتم تعريف الحمض النووي الريبي المرتبط عن طريق التسلسل. إذا كانت مجمعات بروتين الحمض النووي الريبي متشابكة في البداية ، فيمكن لتحليل التسلسل تعيين موقع الارتباط المتقاطع وتحديد موقع ربط البروتين على الحمض النووي الريبي وصولا إلى مستوى النيوكليوتيدات.

لقد شاهدت للتو فيديو JoVE على RNA-seq. في هذا الفيديو، رأينا كيف يتم تحويل عينات الحمض النووي الريبي إلى مكتبات، وتسلسلها، وتحليل البيانات الناتجة، بالإضافة إلى أنواع المعلومات التي يمكن أن يوفرها تحليل التسلسل. بفضل حساسيته ، وإمكانية استخدامه في أي كائن حي ، وانخفاض تكلفة التسلسل ، يتم استخدام تسلسل الحمض النووي الريبي بشكل متزايد في مجالات متعددة من أبحاث علم الوراثة ، وسيوفر نظرة ثاقبة للعديد من الأسئلة المحيطة بوظيفة الخلية وتطورها. شكرا للمشاهدة!

من بين الطرق المختلفة لتقييم التعبير الجيني ، تسلسل الحمض النووي الريبي عالي الإنتاجية ، أو تسلسل الحمض النووي الريبي. جذابة بشكل خاص ، حيث يمكن إجراؤ…