كمي من إندوسوم و ليسوسوم التحركات في الخلايا العصبية المستزرعة باستخدام تحقيقات الفلورسنت

الهدف العام من تحليل التصوير هذا هو مراقبة حركة الحويصلات في الخلايا العصبية وقياسها كمياً بسهولة. يتيح هذا النهج تحليل نقل الغشاء في الخلايا العصبية بطريقة مباشرة وفعالة من حيث الوقت. لبدء هذا الإجراء، انقل الرحم إلى طبق بتري جديد يحتوي على 70%ethanol.

بعد ذلك، يتم نقل الرحم إلى طبق بتري آخر يحتوي على HBSS. ثم تُزال الأجنة من الرحم باستخدام ملاقط تشريح ومقصات جراحية معقمة. بعد ذلك، تُوضع الأجنة في طبق بتري جديد يحتوي على HBSS.

باستخدام المجهر الستيريو، قم بإزالة الجلد والجمجمة واستخرج الأدمغة باستخدام ملاقط التشريح المعقمة. ثم، انقلها إلى طبق بتري آخر يحتوي على HBSS. قم بإزالة السحايا باستخدام ملاقط التشريح المعقمة.

ثم قم بقص المناطق الزائدة. بعد ذلك، انقل القشور إلى طبق بتري جديد يحتوي على HBSS. اجمع كل القشور باستخدام قطارة Disposable أو ماصة سعة 25 milliliter وضعها في أنبوب سعة 15 milliliter.

بعد ذلك، قم بإزالة HBSS باستخدام الماصة. ثم، أضف ثلاثة ملليلتر من محلول إنزيم القشرة الدماغية إلى الأنبوب الذي يحتوي على القشور الدماغية. ضع الأنبوب في حمام مائي وحضنه عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.

بعد ذلك، أضف ثلاثة ملليلترات أخرى من محلول إنزيم القشرة الدماغية إلى الأنبوب الذي يحتوي على القشور، ثم حضنها عند 37 درجة Celsius في حمام مائي لمدة خمس دقائق إضافية. وبعد مرور خمس دقائق، قم بإزالة محلول إنزيم القشرة الدماغية وأضف خمسة ملليلترات من DMEM المحتوي على 10% fetal bovine serum. ثم قم بتفكيك القشور عن طريق السحب والضخ اللطيف باستخدام ماصة سعة خمسة ملليلترات مع طرف P1000 معقم.

بعد ذلك، يتم سحب القشور مرة أخرى باستخدام ماصة سعة 5 مل مع طرف P200. ضع مصفاة خلايا نايلونية بمسام 40 ميكرومتر على أنبوب سعة 50 مل وقم بترشيح المعلق لإزالة الحطام. لاحقاً، يتم طرد المعلق مركزياً عند 420 ×g لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة، ثم يتم إزالة وسط DMEM.

بعد ذلك، أضف خمسة ملليلترات من وسط استنبات القشرة الدماغية وأعد تعليق كتلة الخلايا برفق. ثم قم بعدّ الخلايا باستخدام مقياس كرات الدم (hemocytometer) واضبط تركيز الخلايا باستخدام وسط استنبات القشرة الدماغية. بعد ذلك، ازرع 3 × 10⁶ من العصبونات القشرية في ملليلترين من معلق الخلايا لكل طبق زجاجي القاع سعة 35 ملليلتر مُرمز.

في هذا الإجراء، اخلط 4 µg من البلازميد مع 200 µL من وسط خالٍ من المصل. وفي أنبوب منفصل، خفف 8 µL من كاشف عفن الترانسفكشن (transfection reagent) في 200 µL من وسط خالٍ من المصل. ثم، قم بحضن المحلول لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.

بعد خمس دقائق، اخلط محلول البلازميد ومحلول كاشف عفن الخلايا (transfection reagent) واترك المزيج ليتفاعل لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، أضف المزيج إلى أطباق الزجاج ذات القاع المطلي. قم بحضن الخلايا العصبية عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.

بعد ذلك، استبدل الوسط بـ 2 mL من وسط زراعة القشرة الدماغية وحضّن العصبونات عند 37 °C لمدة تتراوح من يوم إلى يومين. وللتصوير، استخدم مجهر فلورسنت مجهزاً بكاميرا CCD وعدسات شيئية بقوة تكبير 40X. حافظ على درجة الحرارة عند 37 °C باستخدام نظام تحضين.

قم بالتقاط صور للخلايا العصبية بمعدل إطار واحد كل خمس ثوانٍ على مدار فترة زمنية مدتها 100 ثانية، وذلك باستخدام برنامج التقاط الصور. ولتحليل الصور، افتح جميع الصور المتتالية في برنامج ImageJ مع تفعيل خاصية Manual Tracking. ولدمج الصور المتتالية، اختر Image، ثم Stacks، يليه Images to Stack، ثم انقر OK. بعد ذلك، اختر Plugins ثم Manual Tracking.

ستظهر نافذة تتبع (Tracking). انقر على مربع اختيار "إظهار المعلمات" (Show Parameters) وحدد معلمات التتبع في قسم المعلمات (Parameters). ثم انقر على "إضافة مسار" (Add track) لبدء مسار جديد.

بعد تحديد الحويصلات المطلوبة، انقر على مركز الإشارات في الصور المتتابعة لتسجيل إحداثيات xy. كرر هذا الإجراء لجمع إحداثيات xy للحويصلات من جميع الصور المتتابعة، حيث تنتقل كل صورة تلقائياً إلى الصورة التالية بعد اختيار النقطة المرجعية. تُظهر هذه الصورة حركة الحويصلات التي تحتوي على LAMP-EGFP في تغصنات العصبونات القشرية للفئران بعد يومين من عفن التحول (transfection)، والتي بدأت في اليوم الرابع من الزراعة في المختبر (DIV).

تظهر الصورة المدرجة تسلسلاً زمنياً للحويصلات الإيجابية لـ LAMP-EGFP. يشير رأس السهم الأحمر إلى حويصلة متحركة، بينما يشير رأس السهم الأزرق إلى حويصلة ساكنة. وتشير رؤوس السهام البرتقالية إلى إشارات فلورية أعلى.

يوضح الشكل التالي موضع المحور السيني المعتمد على الوقت للحويصلات الإيجابية لـ LAMP-EGFP. الحويصلة الموجودة في الدائرة الحمراء، والمشار إليها بالرمز b، في حالة حركة، بينما الحويصلة الموجودة في الدائرة الزرقاء، والمشار إليها بالرمز a، في حالة سكون. ويشير هذا الرسم البياني الشريطي إلى المسافة الإجمالية لحركة LAMP-EGFP.

ويوضح هذا الرسم البياني الشريطي متوسط مسافة حركة الحويصلات التي تحتوي على LAMP-EGFP.