حل تقارب تنقية البروتين المجمعات التي كتبها Blue الأصلية PAGE والبروتين الارتباط التنميط

الهدف العام لهذه الإستراتيجية التجريبية هو حل التجميعات الوظيفية المتميزة التي قد يشارك فيها البروتين من خلال تجزئة الرحلان الكهربائي لهلام بولي أكريلاميد الأصلي الأزرق لمجمعات البروتين المنقى والتقارب والتنميط الارتباط بقياس الطيف الكتلي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في إضافة معلومات تنظيمية إلى قوائم البروتينات التي تم إنشاؤها بواسطة تنقية التقارب وتجارب قياس الطيف الضخم. تتمثل المزايا الرئيسية لهذا الإجراء في أنه سهل الأداء ، وله دقة جيدة ، ولا يتطلب سوى القليل من العمل أكثر من CMSMS الهلامي التقليدي.

تم تحسين هذا البروتوكول لتنقية مجمعات البروتين من 200 إلى 500 مليون خلية تعبر عن مستويات داخلية من البروتين الموسوم ب FLAG. بعد إذابة حبيبات الخلية ، كما هو موضح في بروتوكول النص ، أضف خمسة ملليلتر من المخزن المؤقت لتحلل الجليد البارد الذي يحتوي على مثبطات DTT والبروتياز إلى تعليق الخلية وقم بتحريمه للخلط. احتضن المعلق على الجليد لمدة 10 دقائق.

انقل معلق الخلية إلى الخالط البارد. قم بتحليل الخلايا ب 20 إلى 30 ضربة ، باستخدام المدقة الضيقة حتى لا يكون هناك لزوجة ملحوظة ، ثم انقل المتجانس إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة الباردة. بعد الطرد المركزي للأنابيب ، انقل المحللة التي تم تطهيرها إلى أنبوب بارد نظيف ، تاركا وراءه ما يقرب من 50 ميكرولترا من المحلل.

وفر 35 ميكرولتر من المحللة لقياس تركيز البروتين ومراقبة التنقية. بعد ذلك ، قم بإزالة المخزن المؤقت من الخرز المعد مسبقا. أعد تعليق الخرزات بملليلتر واحد من المحللة ، ثم تخلط مع باقي المحلل.

احتضان الخليط على عجلة دوارة عند أربع درجات مئوية لمدة ساعة إلى ساعتين. اجمع الخرز على جانب الأنبوب بمغناطيس. اجمع 30 ميكرولتر من المادة المطفية وتخلص من الباقي.

أعد تعليق الخرزات في 0.5 مل من المخزن المؤقت IPP150 عن طريق سحب العينات من أربع إلى ست مرات. ثم انقل التعليق إلى أنبوب بارد سعة 1.5 مل. بعد ذلك ، اغسل الخرزات ثلاث مرات باستخدام 0.5 مل من المخزن المؤقت الأصلي لشطف FLAG.

مع الغسيل الأخير ، انقل الخرزات إلى أنبوب بارد جديد. قم بإزالة المخزن المؤقت جيدا. أعد تعليق الخرزات في 100 ميكرولتر من 200 ميكروغرام لكل مليلتر 3 × 5 الببتيد في المخزن المؤقت للشطف الأصلي.

ثم احتضن عند أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق مع دوران لطيف. اجمع الخرزات بالمغناطيس ، وانقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد بارد. كرر هذه الخطوة مرتين قبل سحب كل الفتحات.

قم بتركيز المصف حتى 25 ميكرولتر في وحدة مرشح الطرد المركزي عن طريق الطرد المركزي عند 10 ، 000 مرة G عند أربع درجات مئوية. قم بإعداد العينة عن طريق إضافة مخزن مؤقت لتحميل العينة الأصلي 4X وإضافة عينة 0.5٪ G-250 إلى الشطف المركز 25 ميكرولتر. قم بتحميل العينة وعلامات الوزن الجزيئي الأصلية ، مع ترك بئر فارغ بينهما.

بعد ذلك ، قم بتحميل 10 إلى 20 ميكرولترا من المخزن المؤقت لتحميل العينة الأصلي 1X في جميع الآبار الفارغة. املأ غرفة الكاثود ب 200 مل من عازلة الكاثود الأزرق الداكن الأصلي 1X PAGE بعناية ، حتى لا تزعج العينات. املأ حجرة الأنود ب 550 مل من المخزن المؤقت الأنود الأصلي 1X PAGE.

قم بتشغيل الجل على 150 فولت لمدة 30 دقيقة. بعد إيقاف التشغيل ، قم بإزالة المخزن المؤقت للكاثود الأزرق الداكن بماصة مصلية واستبدلها بمخزن كاثود أزرق فاتح 1X. بعد الاستمرار في الجري لمدة 60 دقيقة ، افتح كاسيت الجل وتخلص من إحدى لوحات الكاسيت.

يظل الجل متصلا بلوحة الكاسيت الأخرى. ضع الجل في صينية تحتوي على محلول مثبت كاف لتغطيته ، واحتضنه لمدة 30 دقيقة مع رج لطيف. ثم قم بإزالة المحلول المثبت واستبدله بالماء قبل مسح الجل.

للتحضير لقياس الطيف الكتلي ، ضع أولا صفيحة بئر مخروطية الشكل 96 فوق صفيحة أخرى 96 بئر لجمع النفايات. اخترق قاع آبار صفيحة البئر المخروطية القاع 96 بإبرة قياس 21. ثم أضف 200 ميكرولتر من 50٪ أسيتونيتريل ، 0.25٪ حمض الفورميك إلى آبار الصفيحة المثقوبة.

احتضن كومة الطبق في شاكر لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للوحة عند 500 مرة G لمدة دقيقة واحدة ، بحيث يتدفق السائل عبر الثقوب إلى لوحة تجميع النفايات. بعد تكرار خطوات الغسيل مرتين ، املأ آبار صفيحة البئر 96 المثقوبة ب 150 ميكرولتر من بيكربونات الأمونيوم 50 ملليمول.

بعد ذلك ، ضع الجل على سطح نظيف. قم بتقطيع الممر الذي يحتوي على العينة إلى 48 شريحة متطابقة. قطعي كل شريحة إلى قطعتين أو ثلاث قطع أصغر ، باستثناء الشرائح الخمس الأخيرة في الجزء العلوي من الجل.

ضع كل شريحة بالتتابع في بئر واحد من الطرف المثقوب المغسول 96 طبقا جيدا. أضف 50 ميكرولترا من الأسيتونيتريل إلى كل بئر واحتضن الطبق مع الرج لمدة 30 إلى 60 دقيقة. بعد إزالة السائل عن طريق الطرد المركزي ، أضف 200 ميكرولتر من اثنين من مليمترين TSEB و 50 ملليمولار بيكربونات الأمونيوم إلى كل بئر.

احتضن اللوحة مع الرج لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة قبل إزالة السائل عن طريق الطرد المركزي كما كان من قبل. قم بتجفيف قطع الجل بإضافة 200 ميكرولتر من الأسيتونيتريل النقي واحتضانها مع الرج في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة حتى تصبح قطع الجل بيضاء وغير شفافة. بعد إزالة الأسيتونيتريل ، أضف 150 ميكرولترا من التربسين في بيكربونات الأمونيوم الباردة إلى كل بئر.

احتضان الطبق مع الرج عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين. بعد ذلك ، ضع صفيحة سفلية مخروطية نظيفة أسفل اللوحة المحتوية على الجل ، مما يضمن الاتجاه الصحيح للألواح. ثم اجمع السائل الذي يحتوي على الببتيدات عن طريق الطرد المركزي عند 200 مرة G لمدة دقيقة واحدة.

ضع الببتيدات المحتوية على اللوحة في مبخر طرد مركزي وتبخر السائل أثناء تنفيذ الخطوة التالية. أضف 150 ميكرولتر من 50٪ أسيتونيتريل ، 0.25٪ حمض الفورميك إلى قطع الجل. احتضن مع الرج على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.

اجمع السائل في اللوحة المجففة جزئيا عن طريق الطرد المركزي عند 200 مرة جم لمدة دقيقة واحدة. استمر في تبخير الببتيدات التي تحتوي على اللوحة أثناء تنفيذ الخطوة التالية. انقل محاليل الببتيد إلى لوحة الترشيح بالطرد المركزي المغسولة.

ضع صفيحة سفلية مخروطية نظيفة تحتها لجمع الببتيدات والطرد المركزي لكومة الألواح كما كان من قبل. تبخر السائل في اللوحة السفلية المخروطية حتى تجف الآبار تماما. بمجرد أن تجف ، يمكن تغطية اللوحة بغطاء سيليكون وتخزينها عند 20 درجة مئوية تحت الصفر حتى يتم إجراء قياس الطيف الكتلي وتحليل البيانات كما هو موضح في بروتوكول النص.

تظهر النتائج التمثيلية من التجميع الهرمي لملفات تعريف هجرة PAGE الأصلية الزرقاء ل Mta2 والبروتينات المنقاية هنا كمخطط شجيري وخريطة حرارية تمثل شدة البروتين. يظهر ملف تعريف الهجرة ل Mta2 قمتين تشيران على معقدين متميزين. تظهر بعض الوحدات الفرعية ل NuRD نمطا مشابها مع أعلى وفرة في مجموعة الوزن الجزيئي المنخفضة.

على النقيض من ذلك ، تكون الوحدات الفرعية الأخرى ل NuRD أكثر وفرة في مجموعة NuRD ذات الوزن الجزيئي الأعلى. من ناحية أخرى ، فإن متفاعل Mta2 ، Cdk2ap1 ، موجود فقط في مجموعة NuRD ذات الوزن الجزيئي الأعلى. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في يومين ونصف.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر الاحتفاظ بجميع العينات والكواشف على الجليد لتجنب تفكك مجمعات البروتين. يمكن تطبيق هذا الإجراء على أي بروتين ذي أهمية ، بشرط أن ينظر إليه من وسط التقارب عن طريق الشطف التنافسي في الظروف الأصلية. باتباع هذا الإجراء ، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل الترسيب المناعي العكسي أو المتسلسل للتحقق من صحة المجمعات الفرعية المحددة.