حل تقارب تنقية البروتين المجمعات التي كتبها Blue الأصلية PAGE والبروتين الارتباط التنميط

يتمثل الهدف العام لهذه الاستراتيجية التجريبية في تحديد التجمعات الوظيفية المتميزة التي قد يشارك فيها البروتين، وذلك من خلال تجزئة معقدات البروتين المنقاة بالتقارب باستخدام الرحلان الكهربائي لهلام بولي أكريلاميد الأصلي الأزرق (blue native polyacrylamide gel electrophoresis) وتوصيف الارتباط بواسطة مطيافية الكتلة. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في إضافة معلومات تنظيمية إلى قوائم البروتينات الناتجة عن تجارب مطيافية الكتلة للتنقية بالتقارب. وتتمثل المزايا الرئيسية لهذا الإجراء في سهولة تنفيذه، وتمتعه بدقة فصل جيدة، كما أنه لا يتطلب جهداً إضافياً يذكر مقارنةً بطريقة CMSMS التقليدية للهلام.

تم تحسين هذا البروتوكول لتنقية المعقدات البروتينية من 200 إلى 500 مليون خلية تعبر عن مستويات داخلية من بروتين موسوم بـ FLAG. بعد إذابة كتلة الخلايا، كما هو موضح في البروتوكول النصي، أضف خمسة مليلتر من منظم التحلل البارد جداً (ice cold lysis buffer) الذي يحتوي على DTT ومثبطات البروتياز إلى معلق الخلايا وحركه بشكل دائري للمزج. قم بحضن المعلق على الثلج لمدة 10 دقائق.

انقل معلق الخلايا إلى جهاز تجانس مبرد. قم بتحليل الخلايا بإجراء 20 إلى 30 ضربة باستخدام المدقة الضيقة حتى تختفي اللزوجة الملحوظة، ثم انقل المتجانس إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة مبردة. بعد طرد الأنابيب مركزياً، انقل الراشح النقي إلى أنبوب مبرد نظيف، مع ترك حوالي 50 µl من الراشح في الأنبوب الأول.

احتفظ بحصة قدرها 35 µL من المستخلص لقياس تركيز البروتين ومراقبة عملية التنقية. بعد ذلك، قم بإزالة المنظم من الحبيبات التي تم تحضيرها مسبقاً. أعد تعليق الحبيبات باستخدام 1 mL من المستخلص، ثم اخلطها مع بقية المستخلص.

قم بتحضين الخليط على عجلة دوارة عند درجة حرارة 4 °C لمدة تتراوح من ساعة إلى ساعتين. اجمع الحبيبات على جانب الأنبوب باستخدام مغناطيس. اسحب عينة حجمها 30 µL من السائل الطافي وتخلص من الباقي.

أعد تعليق الحبيبات في 0.5 milliliters من منظم IPP150 عن طريق السحب والضخ بالماصة من أربع إلى ست مرات. بعد ذلك، انقل المعلق إلى أنبوب بارد سعة 1.5 milliliter. ثم، اغسل الحبيبات ثلاث مرات باستخدام 0.5 milliliters من منظم FLAG elution native.

مع الغسلة الأخيرة، انقل الخرزات إلى أنبوب جديد مبرد. قم بإزالة المحلول المنظم تماماً. أعد تعليق الخرزات في 100 µL من ببتيد 3X5 بتركيز 200 µg/mL في محلول استخلاص أصلي.

بعد ذلك، يتم التحضين عند درجة حرارة 4 °C لمدة 10 دقائق مع التدوير اللطيف. اجمع الخرزات باستخدام المغناطيس، وانقل الطافي إلى أنبوب جديد مبرد. كرر هذه الخطوة مرتين قبل سحب جميع النواتج المستخلصة.

قم بتركيز النضيد حتى 25 µL في وحدة ترشيح مركزية عن طريق الطرد المركزي عند 10,000 ×g في درجة حرارة 4 °C. جهز العينة بإضافة منظم تحميل العينة الأصلي (4X native sample loading buffer) ومضاف العينة G-250 بتركيز 0.5% إلى النضيد المركز بحجم 25 µL. قم بتحميل العينة ومؤشرات الوزن الجزيئي الأصلي، مع ترك بئر فارغة بينهما.

بعد ذلك، قم بتحميل من 10 إلى 20 µL من منظم تحميل العينات الطبيعي (1X native sample loading buffer) في جميع الآبار الفارغة. املأ غرفة الكاثود بـ 200 mL من منظم الكاثود الأزرق الداكن لـ 1X native PAGE بعناية، بحيث لا يتم تحريك العينات. املأ غرفة الأنود بـ 550 mL من منظم الأنود لـ 1X native PAGE.

قم بتشغيل الهلام بجهد 150 فولت لمدة 30 دقيقة. بعد إيقاف التشغيل، قم بإزالة منظم الكاثود الأزرق الداكن باستخدام ماصة سيرولوجية واستبدله بمنظم كاثود 1X الأزرق الفاتح. بعد مواصلة التشغيل لمدة 60 دقيقة، افتح كاسيت الهلام وتخلص من إحدى ألواح الكاسيت.

يبقى الهلام ملتصقاً بصفيحة الكاسيت الأخرى. ضع الهلام في حوض يحتوي على كمية كافية من محلول التثبيت لتغطيته، ثم قم بتحضينه لمدة 30 دقيقة مع الرج الخفيف. بعد ذلك، قم بإزالة محلول التثبيت واستبداله بالماء قبل مسح الهلام ضوئياً.

للتحضير لعملية مطيافية الكتلة، ضع أولاً صفيحة ذات 96 بئراً ذات قاع مخروطي فوق صفيحة أخرى ذات 96 بئراً لتجميع الفضلات. قم بثقب قاع آبار الصفيحة ذات القاع المخروطي باستخدام إبرة قياس 21. بعد ذلك، أضف 200 µL من 50% acetonitrile و 0.25% formic acid إلى آبار الصفيحة المثقوبة.

يُحضن مكدس الأطباق في هزاز لمدة 10 دقائق. بعد ذلك، يتم طرد الطبق مركزياً بسرعة 500 ×g لمدة دقيقة واحدة، بحيث يتدفق السائل عبر الثقوب إلى طبق تجميع النفايات. بعد تكرار خطوات الغسيل مرتين، تُملأ آبار الطبق ذي الـ 96 بئراً المثقوب بـ 150 µL من بيكربونات الأمونيوم بتركيز 50 mM.

بعد ذلك، ضع الهلام على سطح نظيف. قم بتقطيع المسار الذي يحتوي على العينة إلى 48 شريحة متطابقة. ثم قطع كل شريحة إلى قطعتين أو ثلاث قطع أصغر، باستثناء الشرائح الخمس الأخيرة في الجزء العلوي من الهلام.

ضع كل شريحة بالتتابع في بئر واحد من لوحة 96 بئر ذات نهايات مثقبة ومغسولة. أضف 50 µL من الأسيتونتريل إلى كل بئر واحضن اللوحة مع الرج لمدة تتراوح بين 30 إلى 60 دقيقة. بعد إزالة السائل عن طريق الطرد المركزي، أضف 200 µL من TSEB بتركيز 2 mM وبيكربونات الأمونيوم بتركيز 50 mM إلى كل بئر.

قم بحضن الطبق مع الرج لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة قبل إزالة السائل عن طريق الطرد المركزي كما سبق. قم بإزالة الماء من قطع الهلام بإضافة 200 µL من الأسيتونيتريل النقي والحضن مع الرج في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة حتى تصبح قطع الهلام بيضاء ومعتمة. بعد إزالة الأسيتونيتريل، أضف 150 µL من التربسين في بيكربونات الأمونيوم الباردة إلى كل بئر.

قم بتحضين الطبق مع الرج عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين. بعد ذلك، ضع طبقاً نظيفاً ذا قاع مخروطي أسفل الطبق الذي يحتوي على الهلام، مع التأكد من التوجيه الصحيح للأطباق. ثم، قم بجمع السائل الذي يحتوي على الببتيدات عن طريق الطرد المركزي عند 200 ×g لمدة دقيقة واحدة.

ضع الطبق الذي يحتوي على الببتيدات في مبخر طرد مركزي وقم بتبخير السائل أثناء تنفيذ الخطوة التالية. أضف 150 µL من 50% acetonitrile و 0.25% formic acid إلى قطع الهلام. قم بالتحضين مع الرج عند 37 °C لمدة 30 دقيقة.

قم بتجميع السائل في الطبق المجفف جزئياً عن طريق الطرد المركزي بقوة 200 ×g لمدة دقيقة واحدة. استمر في تبخير الطبق الذي يحتوي على الببتيدات أثناء تنفيذ الخطوة التالية. انقل محاليل الببتيدات إلى طبق الترشيح الطردي المغسول.

ضع لوحة ذات قاع مخروطي نظيفة أسفلها لتجميع الببتيدات، ثم قم بطرد مكدس اللوحات مركزياً كما سبق. بخر السائل الموجود في اللوحة ذات القاع المخروطي حتى تجف الآبار تماماً. وبمجرد جفافها، يمكن تغطية اللوحة بغطاء من السيليكون وتخزينها عند درجة حرارة -20 °C حتى إجراء قياس الطيف الكتلي وتحليل البيانات كما هو موضح في البروتوكول النصي.

تظهر هنا النتائج التمثيلية للتجميع الهرمي لملفات هجرة Mta2 والبروتينات التي تنقي معه على شكل مخطط شجري وخريطة حرارية تمثل كثافات البروتين. يُظهر ملف هجرة Mta2 قمتين تشيران إلى وجود معقدين متميزين. وتُظهر بعض الوحدات الفرعية لـ NuRD نمطاً مشابهاً مع أعلى وفرة في التجمع ذي الوزن الجزيئي المنخفض.

وفي المقابل، تكون الوحدات الفرعية الأخرى لـ NuRD أكثر وفرة في تجميعة NuRD ذات الوزن الجزيئي الأعلى. ومن ناحية أخرى، فإن البروتين المتفاعل مع Mta2، وهو Cdk2ap1، يتواجد فقط في تجميعة NuRD ذات الوزن الجزيئي الأعلى. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون يومين ونصف.

أثناء تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر إبقاء جميع العينات والكواشف على الثلج لتجنب تفكك المعقدات البروتينية. يمكن تطبيق هذا الإجراء على أي بروتين مستهدف، شريطة أن يكون من الممكن استخلاصه من الوسط الألفيني عن طريق الشطف التنافسي في ظروف طبيعية. وبعد اتباع هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل الترسيب المناعي المشترك العكسي أو المتسلسل للتحقق من صحة المعقدات الفرعية المحددة.