3: تحليل مثيلة الحمض النووي

مثيلة الحمض النووي هي تعديل كيميائي للحمض النووي يؤثر على التعبير الجيني في سياقات خلوية مختلفة. يهتم العديد من الباحثين بآلية ووظائف هذه العملية ، حيث ارتبطت مثيلة الحمض النووي الشاذة بأمراض مثل السرطان.

في هذا الفيديو، سنغطي المبادئ الكامنة وراء مثيلة الحمض النووي وطرق اكتشافها. بعد ذلك ، سوف نستكشف بروتوكولا عاما لإحدى هذه الطرق ، تحليل ثنائي الكبريتيت ، وبعض تطبيقات هذه التقنية.

أولا ، دعنا نلقي نظرة على ماهية مثيلة الحمض النووي وكيف يمكن اكتشافها.

خلال هذه العملية الكيميائية الحيوية ، تضيف الخلية علامة كيميائية تعرف باسم مجموعة الميثيل إلى قواعد السيتوزين في حمضها النووي. تحدث معظم السيتوزينات الميثيلية بجوار قواعد الجوانين في نفس خيط الحمض النووي ، ويشار إلى هذه النيوكليوتيدات المجاورة - ورابطة الفوسفوديستر التي تربطها - باسم "CpGs". على الرغم من أن معظم CpGs الفقارية ميثيلية ، إلا أن تلك غير الميثيلية تميل إلى الحدوث بالقرب من بعضها البعض في "جزر" CpG بالقرب من محفزات الجينات المعبر عنها بنشاط ، والعديد من عناصر التسلسل التنظيمي الأخرى.

كيف تساهم التغييرات في مثيلة الحمض النووي في تنظيم الجينات لا تزال موضوعا للتحقيق المكثف. يبدو أن مثيلة جزر CpG مهمة لإسكات الجينات المستقرة وطويلة الأمد التي تظهر في العمليات اللاجينية مثل البصمة الجينومية ، وهو التعبير المحدد لوالد المنشأ لجينات معينة ، بالإضافة إلى تعطيل الكروموسوم X ، وإسكات أحد الكروموسومين X في كل خلية من ثدييات الإناث. كما ثبت أن قمع الجينات الحرجة بسبب المثيلة الشاذة لجزر CpG يساهم في نمو الخلايا غير المنضبط ، مما قد يؤدي إلى الإصابة بالسرطان. ميكانيكيا ، قد تساهم مثيلة الحمض النووي في إسكات الجينات إما عن طريق منع عوامل النسخ من الارتباط بالمروجين ، أو عن طريق تجنيد البروتينات التي تعدل الهستونات وتعيد تشكيل الكروماتين إلى حالة غير متساهلة من الناحية النسخية.

هناك عدة طرق للكشف عن حالة مثيلة الحمض النووي.

تتضمن إحدى التقنيات ، وهي مقايسة HELP ، نوكليازات مقيدة تسمى HpaII و MspI ، والتي تشق على التوالي فقط تسلسلات CCGG غير الميثيلة ، أو على حد سواء الميثيلية وغير الميثيلية. من خلال مقارنة أنماط الهضم التي ينتجها هذان الإنزيمان ، يمكن استنتاج حالة مثيلة الحمض النووي.

تستخدم طريقة أخرى ، تسمى ترسيب مناعي الحمض النووي الميثيلي أو "MeDIP" ، الأجسام المضادة التي ترتبط بالسيتوزين الميثيلي لإثراء تسلسل الحمض النووي الميثيلي.

أخيرا ، يتم استخدام تحليل ثنائي الكبريتيت للتمييز بين السيتوزين الميثوليته وغير الميثيل في الحمض النووي ، عن طريق إجراء تفاعل كيميائي يحول السيتوزين غير الميثيل إلى يوراسيل. بعد هذا التحويل ، يمكن إخضاع الحمض النووي المعالج بثنائي الكبريتيت ل تفاعل البوليميراز المتسلسل وتسلسله ومقارنته بالجينوم المرجعي. السيتوزين غير الميثيل هو تلك الموجودة في المرجع ، ولكن تم استبدالها بالثايمين بعد تحليل ثنائي الكبريتيت و PCR. من خلال إخضاع الحمض النووي المعالج بثنائي الكبريتيت لقياس الطيف الكتلي ، يمكن للباحثين أيضا إنشاء "epigrams مثيلة" ، والتي تمثل خطيا CpGs مختلفة في الجينوم وتصور درجة المثيلة في كل منها. هذه الكتابة مفيدة بشكل خاص إذا رغب الباحثون في مقارنة أنماط المثيلة بين أنواع الخلايا المختلفة.

دعنا الآن نلقي نظرة متعمقة على بروتوكول تحليل ثنائي الكبريتيت.

للبدء ، يضاف هيدروكسيد الصوديوم إلى مستحضرات الحمض النووي الجيني ، والتي يتم حضنها بعد ذلك عند 95 درجة مئوية. هذا يفسد الحمض النووي ويجعل قواعدها في متناول التفاعلات الكيميائية اللاحقة. ثم يتم إدخال ميتابيسلفيت الصوديوم في خليط الحمض النووي المشوه ، وستحدث خطوتان للتفاعل الكيميائي. خلال الخطوة الأولى ، يتم إضافة الكبريتات ، وهي مجموعة كبريتيت إلى السيتوزين غير الميثيل لتكوين سلفونات السيتوزين. بعد ذلك ، أثناء إزالة الأمين المائي ، تتم إزالة مجموعة أمينية من سلفونات السيتوزين لتوليد سلفونات اليوراسيل.

لتسهيل هذه المراحل الأولى من التفاعل الكيميائي ، يتم تغطية مستحضر الحمض النووي بالزيت المعدني ، مما يمنع التبخر ويساعد في الحفاظ على تركيز ميتابيسلفيت الصوديوم. ثم يتم تحضين التفاعل عند 55 درجة مئوية في الظلام. خلال هذه الخطوة ، يضاف أيضا عامل لمنع الأكسدة ، مثل الكينول ، إلى الخليط.

لجمع الحمض النووي المعدل الذي يحتوي على سلفونات اليوراسيل ، وبدون زيت معدني ، يتم طرد الخليط واستعادة أدنى طبقة سائلة. ثم يتم تنقية الحمض النووي في هذا المحلول.

بعد ذلك ، يضاف هيدروكسيد الصوديوم إلى خليط الحمض النووي ، والذي يتم حضنه بعد ذلك عند 37 درجة مئوية. يتم ذلك للحث على إزالة الكبريت ، والذي - كما قد تكون خمنت - يزيل مجموعة الكبريتيت من كبريتات اليوراسيل ، ويشكل اليوراسيل ويكمل التفاعل الكيميائي.

أخيرا ، يتم تحييد الخليط بإضافة أسيتات الأمونيوم ، ويتم جمع الحمض النووي عن طريق ترسيب الإيثانول. بمجرد تنقية الحمض النووي المحول بثنائي الكبريتيت ، يخضع لتفاعل البوليميراز المتسلسل والتسلسل.

والآن بعد أن ناقشنا التقنية الأساسية لتحليل ثنائي الكبريتيت، دعونا نلقي نظرة على بعض التطبيقات التجريبية.

يستخدم بعض الباحثين تحليل ثنائي الكبريتيت للتحقيق في البصمة الجينومية. هنا ، عبر الباحثون سلالتين من نبات الأرابيدوبسيس مع الاختلافات الجينية ، بحيث يمكن التمييز بين الحمض النووي للأم والأب. ثم تمت مقارنة أنماط المثيلة في الأجنة الناتجة والسويداء المرتبطة بها ، أو الأنسجة التي تدعم الجنين. باستخدام هذه الطريقة ، وجد العلماء أن CpGs في أليل الأم لجين مشفر للبروتين ، MEA ، تميل إلى الميثيل في الأجنة ولكن غير ميثيل في السويداء ، مما يشير إلى بصمة خاصة بالأنسجة.

يستخدم باحثون آخرون هذه التقنية لفهم كيف يمكن للعوامل البيئية أو الاجتماعية أن تغير أنماط المثيلة. هنا ، تم فصل صغار الفئران عن أمهاتهم للحث على الإجهاد ، وتم عزل أنسجة دماغهم لاحقا. بعد تسلسل الحمض النووي المعالج بثنائي الكبريتيت ، قرر العلماء أن أنماط المثيلة في جين ترميز الهرمونات ، AVP ، تغيرت في منطقة معينة من الدماغ في الجراء "المنفصلة" ، مما يشير إلى آلية جزيئية محتملة للتأثيرات البيولوجية طويلة المدى لتجربة الحياة المبكرة.

أخيرا ، يحاول العديد من الباحثين تحسين تحليل ثنائي الكبريتيت لتسهيل مقارنة أنماط المثيلة بين الخلايا الفردية الفريدة. هنا ، قام الباحثون بتعديل طريقة تحليل ثنائي الكبريتيت بحيث تم تنفيذ جميع الخطوات على بويضات الفئران الفردية المضمنة في الاغاروز ، مما ساعد على الحماية من فقدان الحمض النووي. باستخدام هذه الطريقة ، تمكن الباحثون من التعرف بسهولة على عينات البويضة المفردة التي كانت ملوثة بخلايا أخرى من خلال البحث عن تلك التي أعطت أنماط مثيلة متعددة.

لقد شاهدت للتو فيديو JoVE حول التحليلات الحساسة للمثيلة. هنا ، ناقشنا الدور الذي تلعبه مثيلة الحمض النووي في تنظيم الجينات ، والطرق التي يستخدمها الباحثون لتحديد المناطق الميثيلية في الجينوم ، وبروتوكول معمم لتحليل ثنائي الكبريتيت ، وأخيرا ، بعض تطبيقات هذه التقنية. كما هو الحال دائما ، شكرا على المشاهدة!