القوة الذرية المجهري التحقيقات من الحمض النووي الآفة الاعتراف في إصلاح ختان النوكليوتيدات

الهدف العام من تجربة الفحص المجهري للقوة الذرية هو حل تفاعلات بروتينات إصلاح الحمض النووي مع مواقع التلف في الحمض النووي والتمييز بين تفاعلات الحمض النووي المختلفة بواسطة مجمعات البروتين المختلفة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال إصلاح الحمض النووي ، مثل كيفية تحقيق نظام إصلاح الحمض النووي المعين التعرف على الآفات المستهدفة في الحمض النووي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكننا رؤية وتحليل الأنواع المختلفة من المجمعات التي تشارك في عملية التعرف على آفة الحمض النووي مباشرة.

سيوضح هذا الإجراء نيكولاس ويرث ، الذي استخدم هذا النهج خلال أبحاث البكالوريوس. للبدء ، قم بإعداد ركيزة مناسبة للحمض النووي عن طريق توليد فجوة DNA أحادية الشريطة في البلازميد. أعد ملء الفجوة باستخدام قليل النوكليوتيدات من الحمض النووي المعدلة أحادية الشريطة ، وأخيرا ، خطية الحمض النووي للبلازما باستخدام إنزيمات التقييد المناسبة.

بالنسبة لهذه التجارب ، يبلغ طول ركائز الحمض النووي المزدوجة التي تقطعت بها السبل حوالي 1000 زوج أساسي وتحتوي على آفة في الحمض النووي بالإضافة إلى منطقة غير متزاوجة تسمى فقاعة الحمض النووي لتحميل البروتين على الحمض النووي. بعد ذلك ، قم بإعداد عينة من البروتين للحمض النووي لتحليل AFM عن طريق سحب 10x Reaction Buffer والماء أولا في أنبوب تفاعل دقيق. ثم أضف الحمض النووي والبروتينات قيد التحقيق.

على سبيل المثال ، هنا ، 100 نانومولار من عينة الحمض النووي وميكرومولار واحد أو كل من بروتينات إصلاح استئصال النوكليوتيدات حقيقية النواة XPD و p44. ثم احتضان التفاعل لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في كتلة حرارية. بعد الحضانة ، قم بتدوير العينة لفترة وجيزة.

بعد ذلك ، قم بإعداد ركيزة الميكا لوضع العينة عليها. استخدم مشرطا لقطع قطعة من الميكا بطول سنتيمتر واحد في سنتيمتر واحد من شريط أكبر. بعد ذلك ، استخدم قطعة من الشريط اللاصق لإزالة الطبقات العليا من الميكا للكشف عن سطح ركيزة نظيف ومسطح وسلس تشريحيا.

قم بتوسيع عينة البروتين من خمسين إلى مائة ضعف في المخزن المؤقت لترسيب AFM ، وقم على الفور بإيداع 20 ميكرولترا من العينة المخففة على سطح الميكا. يعتمد عامل التخفيف على تركيز العينة. مباشرة بعد إيداع العينة على سطح الميكا ، اشطف العينة ثلاث إلى أربع مرات ببضعة ملليلترات من الماء المصفى منزوع الأيونات وامسح السوائل الزائدة.

استخدم تيارا لطيفا من النيتروجين لتجفيف العينة. أخيرا ، استخدم شريطا لاصقا لتثبيت العينة عند حوافها على شريحة مجهرية. ضع العينة في منتصف مرحلة AFM واستخدم وسادات مغناطيسية لتثبيت شريحة المجهر على المسرح.

ثم أدخل طرف AFM في حامل الطرف. ثبت الطرف في الحامل تحت المشبك عن طريق شد المسمار بحيث يكون بإحكام إصبعه. بمجرد تثبيته، أدخل حامل الطرف في رأس قياس AFM.

استخدم براغي تحديد المواقع لتحريك العينة في موضع مركزي. ضع رأس قياس AFM أعلى العينة ، وتأكد من أن الرأس يقف بثبات مع ساقيه داخل المسافات البادئة للمرحلة. بعد ذلك ، قم بمحاذاة ليزر AFM على الجزء الخلفي من الكابول للحصول على قوة الإشارة المثلى.

شاهد إشارة الانعكاس في نافذة فيديو AFM لوضع الليزر بشكل فظ. بالنسبة لطراز AFM هذا ، أدر عجلات الجانب الأيمن والخلفي من رأس قياس AFM لضبط موضعي X و Y لليزر AFM لتوجيهه مركزيا إلى نهاية الكابولي. بعد ذلك ، قم بتحسين إشارة مجموع الكاشف عن طريق ضبط موضع الليزر باستخدام العجلتين.

قم بتوجيه انعكاس ليزر AFM إلى مركز الكاشف عن طريق تصفير الإشارة المختلفة من الثنائيات العلوية والسفلية لمجموعة الكاشف. في هذه الخطوة، أدر المسمار الموجود على الجانب الأيسر من رأس القياس لطراز AFM هذا. بعد ذلك ، حدد تردد الإقامة الكابولية بالانتقال إلى نافذة ضبط اللوحة الرئيسية في البرنامج.

اختر اتساعا يتوافق مع مدخل فولت واحد ل Piezo الذي يقود التذبذب الكابولي ثم اضبط تردد التذبذب على سالب 5٪ أقل قليلا من تردد الإقامة. الآن قم بإجراء ضبط تردد تلقائي وصفر مرحلة التذبذب. اترك النظام للوصول إلى التوازن الحراري لمدة ساعة تقريبا قبل بدء التصوير ، لتجنب الانجراف.

عندما تكون مستعدا لبدء التصوير، في اللوحة الرئيسية للبرنامج، قم بتعيين نقطة ضبط واقية واستعد للاقتراب من الطرف إلى سطح العينة عن طريق تحديد التعشيق. اخفض العجلة الأمامية لرأس AFM يدويا حتى يتم الوصول إلى إعداد الحماية أو نقطة الضبط. بعد ذلك ، اخفض العجلة الأمامية بعناية حتى يتم تمديد إشارة مستشعر Z بالكامل إلى اليسار.

قم بتنشيط طاولة تذبذب الاهتزاز وأغلق حاوية العزل الصوتي. بعد ذلك ، قم بخفض نقطة الضبط في برنامج AFM باستخدام عجلة الهامستر لإشراك طرف AFM بالعينة. لإجراء تصوير وضع التنصت في النظام المثير للاشمئزاز ، قم بخفض نقطة الضبط حتى تصبح إشارة الطور أقل قليلا من مرحلة المستوى الحر.

ثم ابدأ في مسح العينة. استخدم سرعة المسح الضوئي البالغة 2.5 ميكرومتر في الثانية في مساحات سطح الصورة التي تبلغ أربعة ميكرومتر × أربعة ميكرومتر أو ثمانية ميكرومتر × ثمانية ميكرومتر مربعات بدقة بكسل تبلغ 2 أو 048 أو 4 ، 096 ، على التوالي ؛ واضغط على زر Do Scan (إجراء مسح). حدد مسبقا مجمعات الحمض النووي للبروتين ذات الصلة عن طريق الفحص البصري المباشر للصور في برنامج AFM.

بالنسبة لعينات XPD ، تشمل المجمعات المحتملة XPD p44 DNA ، بالإضافة إلى XPD DNA و p44 DNA بأحجام مختلفة بشكل واضح بسبب الكتل الجزيئية المختلفة ل XPD و p44. قم بقياس أحجام قمم البروتين الفردية على الحمض النووي باستخدام أداة القسم في نافذة التحليل لقياس ارتفاع وقطر أقسام ذروة البروتين باستخدام مؤشرات نافذة القسم. استخدم هذه القيم لتحديد حجم القمم باستخدام نماذج رياضية بسيطة للتحقق من النوع المركب.

أخيرا ، قم بمعايرة نظام AFM الخاص بك بمجموعة من البروتينات ذات الأوزان الجزيئية المعروفة لترجمة هذه الأحجام إلى أوزان جزيئية تقريبية للبروتينات ومجمعات البروتين. من أجل تحديد ميزات إضافية ، مثل أطوال شظايا الحمض النووي ، ومواضع مجمعات البروتين على الحمض النووي وخصائص الموقع المستهدف أو زوايا نطاق الحمض النووي ، راجع بروتوكول النص المصاحب. تظهر هنا صورة AFM بثلاثة أنواع مختلفة من المجمعات المرتبطة بالحمض النووي والتي يمكن تمييزها بناء على أحجامها المختلفة.

تتوافق مجمعات الفئة الأولى مع العامل المشترك المنشط للهليكاز فقط p44 ، وتتكون مجمعات الفئة الثانية من بروتين XPD فقط ، وتتكون مجمعات الفئة الثالثة من كل من XPD و p44 حيث يتطلب التعرف على الفيلق بواسطة XPD تنشيط نشاط الهليكاز بواسطة p44 ، وتظهر مجمعات الفئة الثالثة فقط التعرف على الآفات. من أجل تحديد استراتيجيات التعرف على الآفات المختلفة ، تم قياس مواقع البروتينات على ركائز الحمض النووي لتحميل البروتين في فقاعة الحمض النووي إما في الاتجاهات الأولية الخمسة أو الثلاثة الأولية من آفة الحمض النووي الموضحة باللون الأحمر لطائرات الهليكوبتر بدائية النواة وحقيقية النواة. في توزيعات موضع البروتين ، يمكن اعتبار التعرف على آفة الحمض النووي ذروة بسبب الارتباط المعزز في موضع آفة الحمض النووي.

يظهر NER بدائية النواة الهليكاز UVRB ونظيره حقيقي النواة ، XPD ، استراتيجيات مختلفة للتعرف على آفة CPD تشير إلى تفضيلات مختلفة لخيط الحمض النووي. على وجه التحديد ، يتم التعرف على آفات CPD على الخيط المنقول بواسطة UVRB ، ولكن بشكل تفضيلي على الخيط المعاكس غير المنقول بواسطة XPD. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه الطريقة في غضون ساعات أو أيام قليلة بما في ذلك التحليل.

من المهم العمل مع عينات البروتين والحمض النووي عالية النقاء لتتمكن من تفسير الميزات الموجودة في صور AFM وتصميم ركيزة الحمض النووي بعناية اعتمادا على النظام البيولوجي والسؤال الذي تريد معالجته. بالإضافة إلى ذلك ، فإن طرق المجموعة ، مثل مساحة الرحلان الكهربائي للهلام ، أو تحول الحركة الكهربائية ، أو فحوصات شق الحمض النووي ، هي بالطبع مكملة للغاية لتجارب AFM هذه. ويمكن أن تساعد هذه الطرق في معالجة أسئلة إضافية ، مثل التقارب المرتبط بالحمض النووي أو أنشطة استئصال آفة الحمض النووي. هذه التقنية هي طريقة سريعة وبسيطة نسبيا لتصور مجمعات الحمض النووي للبروتين بشكل مباشر ، وتعطينا هذه المجمعات صورة جيدة للعمليات التي تحدث في النظام البيولوجي.

بالطبع ، هذا ليس مفيدا فقط في فهم عمليات إصلاح الحمض النووي ، ولكن يمكن أيضا تطبيقه على أنظمة الحمض النووي للبروتين الأخرى. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن تكون لديك فكرة جيدة عن كيفية تحضير عينة على نظام البروتين المفضل لديك ، وكيفية تصويرها بواسطة AFM ، وكيفية استخراج معلمات مفيدة لتفسير بياناتك.