الكشف عن التعبير ميكرورنا في الغشاء البريتوني من الفئران باستخدام الكمي في الوقت الحقيقي ير

الهدف العام من هذا الإجراء هو تنقية واكتشاف miRNAs بنجاح في الغشاء البريتوني للفئران. لبدء هذا الإجراء, بعد التخدير الاستنشاقي مع 4٪ الأيزوفلوران. رش جلد البطن من الفئران مع 70٪ الإيثانول وتركيبه على ورقة الفلين, على ظهره'ظهر.

بعد ذلك ، قم بعمل شق طولي في جلد بطن وعضلاته وغشائه البريتوني باستخدام المقص والملقط. التقط الغشاء البريتوني باستخدام الملقط وقم بعمل شقوق أفقية على الجزء العلوي منه على طول عظم الضلع السفلي تحت الحجاب الحاجز. وعلى جانبها السفلي على المنطقة الجانبية باستخدام المقص الجراحي.

بعد ذلك ، قم بعمل شقوق طولية جانبية لإزالة الغشاء البريتوني من الجسم باستخدام المقص الجراحي. ثم اغسله باستخدام PPS في طبق بتري. قطع وتقليم 20 ملليغرام من عينة الغشاء البريتوني.

في هذا الإجراء ، ضع عينة من الغشاء البريتوني 20 ملليغرام في الخالط الزجاجي. وأضف 700 ميكرولتر من كاشف التحلل القائم على الفينول جوانيدين. بعد ذلك ، قم بتجانس عينة الغشاء البريتوني على الجليد ، عن طريق إبطاء الضغط على مدقة على العينة مع الالتواء.

كرر هذه العملية عدة عشرات من المرات ، حتى تذوب عينة الغشاء البريتوني تماما في كاشف التحلل القائم على الفينول جوانيدين. لمزيد من التجانس ، انقل المحللة المتجانسة إلى نظام تمزيق البوليمر الحيوي في عمود دوران الطرد المركزي الصغير في أنبوب تجميع ملليلتر. ثم قم بالطرد المركزي عند 14،000 مرة G لمدة ثلاث دقائق عند أربع درجات مئوية.

بعد ذلك ، قم بنقل المحللة المتجانسة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد. أضف 140 ميكرولترا من الكلوروفورم إلى المحللة المتجانسة وقم بتغطية الأنبوب بإحكام. بعد ذلك ، امزج الأنبوب عن طريق الانعكاس لمدة 15 ثانية.

بعد ذلك ، احتضن العينة لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي عند 12،000 مرة G لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية. انقل 300 ميكرولتر من المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد ، دون إزعاج المرسب.

وأضف 450 لترا صغيرا من الإيثانول بنسبة 100٪. ثم امزج العينة عن طريق الدوامة لمدة خمس ثوان. بعد ذلك ، قم بوضع ماصة تصل إلى 700 لتر ميكرو من العينة في عمود دوران قائم على غشاء السيليكون ، ووضعها في أنبوب تجميع سعة ملليلترين ، وأغلق الغطاء.

ثم قم بجهاز الطرد المركزي عند 15 ، 000 مرة G لمدة 15 ثانية. بعد الطرد المركزي ، تخلص من التدفق في أنبوب التجميع. ثم أضف 700 ميكرولتر من مخزن الغسيل المؤقت 1 ، إلى عمود الدوران القائم على غشاء السيليكون لغسل العينة بدقة وإغلاق الغطاء.

الطرد المركزي عند 15 ، 000 مرة G لمدة 15 ثانية. بعد الطرد المركزي ، تخلص من التدفق في أنبوب التجميع. أضف 500 ميكرولتر من مخزن الغسيل المؤقت 2 ، إلى عمود الدوران القائم على غشاء السيليكا ، لإزالة أي أثر للملح ، وأغلق الغطاء.

ثم قم بجهاز الطرد المركزي عند 15 ، 000 مرة G لمدة 15 ثانية. بعد الطرد المركزي ، تخلص من التدفق عبر أنبوب التجميع وكرر هذا الإجراء مرة أخرى. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي لعمود الدوران القائم على غشاء السيليكا مرة أخرى عند 15 ، 000 مرة G لمدة دقيقة واحدة.

بعد الطرد المركزي ، تخلص من أنبوب التجميع وأي تدفق من خلاله. ضع عمود الدوران القائم على غشاء السيليكا في أنبوب تجميع جديد بسعة خمسة ملليلتر. ثم انقل 25 ميكرولترا من الماء الخالي من RNase إلى العمود وأغلق الغطاء.

اترك العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. جهاز الطرد المركزي عند 15 ، 000 مرة G لمدة دقيقة واحدة. بعد ذلك ، انقل 25 ميكرولتر الذي يحتوي على إجمالي الحمض النووي الريبي إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد وقم بتخزينه عند 80 درجة مئوية تحت الصفر قبل الاستخدام.

في هذا الإجراء ، قم بإعداد محلول مزيج رئيسي يحتوي على ميكرولترين من مزيج الحمض النووي 10x ، وميكرولترين من مزيج النسخ العكسي ، وأربعة ميكرولترات من 5x Hispec buffer ، ليصبح المجموع 8 ميكرولتر لكل أنبوب. ثم قم بتوزيع 8 ميكرولتر من محلول الخلط الرئيسي في كل أنبوب. قم بقياس كمية إجمالي الحمض النووي الريبي باستخدام مقياس الطيف الضوئي.

بعد ذلك ، أضف ميكروغراما واحدا من الحمض النووي الريبي الكلي المعزول ، المنقى من عينة الغشاء البريتوني ، إلى كل أنبوب. بعد ذلك ، أضف الماء الخالي من RNase إلى كل أنبوب ليصل المجموع إلى 20 ميكرولترا. ثم امزجها جيدا عن طريق سحب العينة والطرد المركزي لمدة 15 ثانية.

بعد ذلك ، احتضان العينة لمدة 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية. ثم احتضنها لمدة خمس دقائق عند 95 درجة مئوية. انقل (كدنا) المتولد حديثا إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد وقم بتخفيفه 10 مرات بالماء الخالي من RNase.

في هذا الإجراء ، قم بإعداد مزيج رئيسي يحتوي على 12 نقطة خمسة ميكرولتر من مزيج رئيسي 2x PCR ، ونقطتين وخمسة ميكرولتر من خمسة ميكرولتر من كل ميكرومولار من كل ميكرومولار لكل ميكرومولار مذابة في ماء خال من النوكلياز ، ونقطة واحدة وخمسة ميكرولتر من 10x التمهيدي العالمي ، لكل بئر. قم بتوزيع 22 نقطة خمسة ميكرولتر من هذا المزيج الرئيسي في كل بئر من لوحة 96 بئر. ثم أضف اثنين من نقاط وخمسة ميكرولتر من قالب (كدنا) إلى كل بئر.

أغلق لوحة تفاعل 96 جيدا بقطعة من الفيلم. ثم قم بالطرد المركزي عند 1 ، 000 مرة G لمدة 30 ثانية. لتشغيل برنامج ركوب الدراجات PCR ، اضبط اللوحة في أداة PCR في الوقت الفعلي.

في برنامج PCR في الوقت الفعلي ، حدد الخصائص التجريبية. بعد ذلك ، قم بتعيين أسماء للعينات واستهداف miRNAs في كل بئر. ثم في الوقت الفعلي ، يقوم برنامج PCR بإدخال حجم تفاعل يبلغ 20 لترا صغيرا وظروف دورة PCR التالية وفقا للتعليمات.

قبل الحضانة عند 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. ثم 40 دورة من التمسخ عند 94 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، والركوع عند 55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، وتمتد عند 70 درجة مئوية لمدة 30 ثانية. استنادا إلى miRNA ، فحص المصفوفة الدقيقة ، تم العثور على زيادة كبيرة في مستويات ستة miRNAs في الغشاء البريتوني لفئران التليف البريتوني ، مقارنة بتلك الموجودة في الفئران الوهمية وفئران التحكم ، باستخدام QRTCPR ، باتباع البروتوكول المقدم في هذه المخطوطة.