الكروماتين المناعي
ترسيب مناعي الكروماتين ، أو "ChIP" ، هو تقنية يستخدمها الباحثون لتقييم تفاعلات البروتين والحمض النووي. تلعب عوامل البروتين أدوارا مهمة في تنظيم الجينات. فهي لا تنظم الحمض النووي في الكروموسومات فحسب ، بل ترتبط أيضا بتسلسلات محددة من الحمض النووي - تسمى المواقع التنظيمية - لتنشيط أو قمع التعبير. أثناء ChIP ، يكون الكروماتين - الذي يتكون من الحمض النووي والبروتينات المرتبطة به - "مترسبا مناعيا" ، مما يعني أنه معزول من خلال استخدام الأجسام المضادة. باستخدام هذه الطريقة ، يمكن للباحثين تقييم البروتينات المرتبطة بتسلسل الحمض النووي.
في هذا الفيديو ، سنراجع تعديلات الكروماتين وأدوارها في التنظيم اللاجيني ، وكيف يمكن ل ChIP فحص هذه التعديلات. سنصف بعد ذلك إجراء معمما لهذه التقنية ، وأخيرا نناقش كيفية استخدام العلماء ل ChIP في البحث اليوم.
لنبدأ بمراجعة ماهية تعديلات الكروماتين ، وكيفية دراستها باستخدام ChIP.
في حقيقيات النوى ، يتم تخزين الحمض النووي في النوى عن طريق "لف" حول مجمعات البروتين. هذه البروتينات عبارة عن هيستونات ، ويشار إلى كل مركب هيستون ملفوف بالحمض النووي باسم "النيوكليوسوم". يتم تنظيم التعبير الجيني عن طريق "شغل النيوكليوسوم" ، أو ما إذا كان امتداد الحمض النووي معبأ في النيوكليوسومات. يميل الحمض النووي المنسوخ إلى أن يكون موجودا في مناطق "خالية من النيوكليوسوم" ، مما يسمح للبروتينات بالارتباط بالمواقع التنظيمية للجين ، وتمكين بوليميراز الحمض النووي الريبي من إجراء النسخ.
تشير الأدلة الحالية إلى أن التغييرات في بنية الكروماتين التي تنظم التعبير الجيني يتم التوسط فيها عن طريق التعديلات الكيميائية التي يتم إجراؤها على الهستونات ، عادة في "ذيولها" التي تتحرك بحرية. أكثرها شيوعا هي مجموعات الأسيتيل والميثيل والفوسفات التي تتم إضافتها إلى أو إزالة الأحماض الأمينية المحددة ، ويلاحظ أن هذه التعديلات المختلفة في هيستون مرتبطة بمستويات أو أنماط مختلفة من التعبير الجيني.
على سبيل المثال ، تم ربط إضافة ثلاث مجموعات ميثيل إلى بقايا اللايسين السابعة والعشرين في وحدة هيستون الفرعية H3 - وهو تعديل يسمى H3K27me3 - بإسكات الجينات. بدلا من ذلك ، ارتبط تعديل H3K9ac ، حيث تتم إضافة مجموعة الأسيتيل إلى بقايا اللايسين التاسعة على هيستون H3 ، بتنشيط الجينات.
يفترض أن تعديلات هيستون تلعب دورا في التنظيم اللاجيني للتعبير الجيني عن طريق تمييز مناطق الكروماتين على أنها "نشطة" أو "صامتة". تتمثل إحدى الآليات التي يعتقد من خلالها أن تعديلات الهيستون تمارس آثارها في تجنيد عوامل النسخ أو إنزيمات "إعادة تشكيل" الكروماتين ، والتي تحرك الأخيرة فعليا مواضع النيوكليوسومات.
باستخدام ChIP ، يمكن استهداف تعديلات هيستون محددة بواسطة الأجسام المضادة ، والتي يمكن "سحبها" جنبا إلى جنب مع الحمض النووي المحيط. يمكن للباحثين بعد ذلك استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل أو المصفوفات الدقيقة أو التسلسل لتحديد مناطق الحمض النووي المرتبطة بتعديلات الهيستون ذات الأهمية. من خلال تغيير الأجسام المضادة المستخدمة أثناء ChIP ، يمكن أن تساعد هذه التقنية أيضا في تحديد مناطق الحمض النووي المرتبطة بعوامل النسخ والبروتينات التنظيمية الأخرى.
الآن بعد أن تعرفت على المبادئ الكامنة وراء ChIP ، دعنا ننتقل إلى إجراء معمم لهذه التقنية.
للبدء ، يتم جمع الخلايا ذات الأهمية ومعالجتها بمواد كيميائية مثل الفورمالديهايد ، والتي تعمل ككواشف "متقاطعة" وتساعد في لصق البروتينات على تسلسل الحمض النووي الذي ترتبط به من خلال تسهيل تكوين الروابط التساهمية بينهما. يجب توخي الحذر حتى لا "الإفراط في معالجة" الخلايا بالفورمالديهايد ، لأن هذا يمكن أن يؤثر على قدرة الأجسام المضادة على التعرف على تعديلات الهيستون المستهدفة في مراحل ChIP اللاحقة. لإيقاف عملية الربط المتقاطع ، يضاف الجلايسين إلى محلول الفورمالديهايد الذي تتم معالجة الخلايا به. ثم يتم جمع الخلايا وتحللها لإطلاق الكروماتين.
لإذابة الكروماتين وتحديد مناطق الحمض النووي التي ترتبط بالهيستونات المعدلة بدقة ، يتم "قص" الكروماتين ميكانيكيا إلى قطع أصغر باستخدام الموجات الصوتية - وهي عملية تسمى الصوتنة. عادة ، يهدف العلماء إلى إنشاء شظايا كروماتين يتراوح طولها من 200 إلى 1000 زوج أساسي. بمجرد إنشاء شظايا كروماتين بالحجم المطلوب ، يضاف جسم مضاد إلى المحلول ، ويتم تحضين الخليط لإعطاء الجسم المضاد وقتا للتعرف على تعديل هيستون المستهدف.
ثم يتم إدخال الخرز المغناطيسي الذي يمكن أن ترتبط به الأجسام المضادة في الخليط ، مما يؤدي إلى شل حركة مجمعات الكروماتين المرتبطة بالأجسام المضادة. يتم جمع الخرزات من خلال استخدام الرفوف المغناطيسية ، وغسلها عدة مرات لشطف أي كروماتين أو أجسام مضادة غير مرتبطة.
لتحرير الكروماتين منها ، توضع الخرزات في محلول يحتوي على المنظفات SDS ، وبعد جمع الخرزات بمغناطيس ، يتم الاحتفاظ بالمادة الطافية. ثم يضاف إنزيم بروتيناز K إلى هذا المحلول لتحلل جميع البروتينات ، بما في ذلك الهستونات ، بحيث يمكن عزل مكون الحمض النووي للكروماتين. ثم يتم تنقية الحمض النووي الناتج وتحليله.
دعنا الآن نلقي نظرة على كيفية استخدام العلماء حاليا ل ChIP في مختبراتهم.
يستخدم العديد من الباحثين ChIP لتقييم التغييرات في تعديلات الهيستون الناتجة عن الإشارات خارج الخلية. هنا ، تمت معالجة الخلايا البشرية المستنبتة بسيتوكين معين ، أو جزيء إشارات ، وتم تقييم التغيرات في مثيلة الهيستون. من خلال فحص ChIP DNA باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي ، قرر الباحثون أنه - استجابة للعلاج - اكتسب جين ترميز عامل النسخ IRF1 علامة هيستون منشطة ، H3K36me3. مكن هذا التعديل كلا من البروتين التنظيمي وبوليميراز الحمض النووي الريبي II من الارتباط ب IRF1 ، مما أدى إلى نسخه.
يمكن أيضا استخدام ChIP لاكتساب نظرة ثاقبة للتغيرات في التعبير الجيني التي تحدث أثناء إصابة الأنسجة وتجديدها. في هذه التجربة ، أتلف الباحثون أحد مكونات الجهاز العصبي المحيطي في الفئران - العصب الوركي - ثم استخدموا ChIP للبحث عن تفاعلات جديدة بين البروتين الحمض النووي في هياكل الجهاز العصبي المحيطي الأخرى ، مثل العقد التي تحيط بالحبل الشوكي. خلص العلماء إلى أنه بعد إصابة الأعصاب ، أصبح بروتين p53 ، وهو منظم لإصلاح الحمض النووي ، مرتبطا بجين متورط في تجديد الأنسجة ، GAP43 .
أخيرا ، يعمل بعض العلماء على تبسيط إجراءات ChIP لزيادة إنتاجية التجارب وكفاءتها. هنا ، تمكن الباحثون من "أتمتة" ChIP ، مما يجعل الآلة تؤدي العديد من الخطوات في البروتوكول. سمح ذلك للباحثين بتقييم الحمض النووي المرتبط بالعديد من تعديلات الهيستون المختلفة في وقت واحد ، باستخدام عدد صغير نسبيا من الخلايا - 10,000 - مما أدى إلى نتائج مشابهة لتلك التي شوهدت بأعداد خلايا أكبر ، أو مع تقنيات ChIP "اليدوية" القياسية.
لقد شاهدت للتو فيديو JoVE حول ترسيب الكروماتين المناعي. في هذا الفيديو، ناقشنا كيف يشكل الحمض النووي والبروتينات معا الكروماتين، وخطوات بروتوكول، يسمى ChIP، والذي يمكن استخدامه لتحديد تسلسلات الحمض النووي المرتبطة بحالات أو بروتينات كروماتين معينة. استكشفنا أيضا كيف يستخدم الباحثون ChIP ويعدله لفهم دور تفاعلات الحمض النووي والبروتين أثناء تنظيم الجينات بشكل أفضل. كما هو الحال دائما ، شكرا على المشاهدة!
الهستونات هي بروتينات تساعد في تنظيم الحمض النووي في النوى حقيقية النواة من خلال العمل ك "سقالات" يمكن لف الحمض النووي حولها ، وتشكيل مركب يسمى "الكرو…
ترسيب مناعي الكروماتين ، أو "ChIP" ، هو تقنية يستخدمها الباحثون لتقييم تفاعلات البروتين والحمض النووي. تلعب عوامل البروتين أدوارا مهمة في تنظيم الجينات. فهي لا تنظم الحمض النووي في الكروموسومات فحسب ، بل ترتبط أيضا بتسلسلات محددة من الحمض النووي - تسمى المواقع التنظيمية - لتنشيط أو قمع التعبير. أثناء ChIP ، يكون الكروماتين - الذي يتكون من الحمض النووي والبروتينات المرتبطة به - "مترسبا مناعيا" ، مما يعني أنه معزول من خلال استخدام الأجسام المضادة. باستخدام هذه الطريقة ، يمكن للباحثين تقييم البروتينات المرتبطة بتسلسل الحمض النووي.
في هذا الفيديو ، سنراجع تعديلات الكروماتين وأدوارها في التنظيم اللاجيني ، وكيف يمكن ل ChIP فحص هذه التعديلات. سنصف بعد ذلك إجراء معمما لهذه التقنية ، وأخيرا نناقش كيفية استخدام العلماء ل ChIP في البحث اليوم.
لنبدأ بمراجعة ماهية تعديلات الكروماتين ، وكيفية دراستها باستخدام ChIP.
في حقيقيات النوى ، يتم تخزين الحمض النووي في النوى عن طريق "لف" حول مجمعات البروتين. هذه البروتينات عبارة عن هيستونات ، ويشار إلى كل مركب هيستون ملفوف بالحمض النووي باسم "النيوكليوسوم". يتم تنظيم التعبير الجيني عن طريق "شغل النيوكليوسوم" ، أو ما إذا كان امتداد الحمض النووي معبأ في النيوكليوسومات. يميل الحمض النووي المنسوخ إلى أن يكون موجودا في مناطق "خالية من النيوكليوسوم" ، مما يسمح للبروتينات بالارتباط بالمواقع التنظيمية للجين ، وتمكين بوليميراز الحمض النووي الريبي من إجراء النسخ.
تشير الأدلة الحالية إلى أن التغييرات في بنية الكروماتين التي تنظم التعبير الجيني يتم التوسط فيها عن طريق التعديلات الكيميائية التي يتم إجراؤها على الهستونات ، عادة في "ذيولها" التي تتحرك بحرية. أكثرها شيوعا هي مجموعات الأسيتيل والميثيل والفوسفات التي تتم إضافتها إلى أو إزالة الأحماض الأمينية المحددة ، ويلاحظ أن هذه التعديلات المختلفة في هيستون مرتبطة بمستويات أو أنماط مختلفة من التعبير الجيني.
على سبيل المثال ، تم ربط إضافة ثلاث مجموعات ميثيل إلى بقايا اللايسين السابعة والعشرين في وحدة هيستون الفرعية H3 - وهو تعديل يسمى H3K27me3 - بإسكات الجينات. بدلا من ذلك ، ارتبط تعديل H3K9ac ، حيث تتم إضافة مجموعة الأسيتيل إلى بقايا اللايسين التاسعة على هيستون H3 ، بتنشيط الجينات.
يفترض أن تعديلات هيستون تلعب دورا في التنظيم اللاجيني للتعبير الجيني عن طريق تمييز مناطق الكروماتين على أنها "نشطة" أو "صامتة". تتمثل إحدى الآليات التي يعتقد من خلالها أن تعديلات الهيستون تمارس آثارها في تجنيد عوامل النسخ أو إنزيمات "إعادة تشكيل" الكروماتين ، والتي تحرك الأخيرة فعليا مواضع النيوكليوسومات.
باستخدام ChIP ، يمكن استهداف تعديلات هيستون محددة بواسطة الأجسام المضادة ، والتي يمكن "سحبها" جنبا إلى جنب مع الحمض النووي المحيط. يمكن للباحثين بعد ذلك استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل أو المصفوفات الدقيقة أو التسلسل لتحديد مناطق الحمض النووي المرتبطة بتعديلات الهيستون ذات الأهمية. من خلال تغيير الأجسام المضادة المستخدمة أثناء ChIP ، يمكن أن تساعد هذه التقنية أيضا في تحديد مناطق الحمض النووي المرتبطة بعوامل النسخ والبروتينات التنظيمية الأخرى.
الآن بعد أن تعرفت على المبادئ الكامنة وراء ChIP ، دعنا ننتقل إلى إجراء معمم لهذه التقنية.
للبدء ، يتم جمع الخلايا ذات الأهمية ومعالجتها بمواد كيميائية مثل الفورمالديهايد ، والتي تعمل ككواشف "متقاطعة" وتساعد في لصق البروتينات على تسلسل الحمض النووي الذي ترتبط به من خلال تسهيل تكوين الروابط التساهمية بينهما. يجب توخي الحذر حتى لا "الإفراط في معالجة" الخلايا بالفورمالديهايد ، لأن هذا يمكن أن يؤثر على قدرة الأجسام المضادة على التعرف على تعديلات الهيستون المستهدفة في مراحل ChIP اللاحقة. لإيقاف عملية الربط المتقاطع ، يضاف الجلايسين إلى محلول الفورمالديهايد الذي تتم معالجة الخلايا به. ثم يتم جمع الخلايا وتحللها لإطلاق الكروماتين.
لإذابة الكروماتين وتحديد مناطق الحمض النووي التي ترتبط بالهيستونات المعدلة بدقة ، يتم "قص" الكروماتين ميكانيكيا إلى قطع أصغر باستخدام الموجات الصوتية - وهي عملية تسمى الصوتنة. عادة ، يهدف العلماء إلى إنشاء شظايا كروماتين يتراوح طولها من 200 إلى 1000 زوج أساسي. بمجرد إنشاء شظايا كروماتين بالحجم المطلوب ، يضاف جسم مضاد إلى المحلول ، ويتم تحضين الخليط لإعطاء الجسم المضاد وقتا للتعرف على تعديل هيستون المستهدف.
ثم يتم إدخال الخرز المغناطيسي الذي يمكن أن ترتبط به الأجسام المضادة في الخليط ، مما يؤدي إلى شل حركة مجمعات الكروماتين المرتبطة بالأجسام المضادة. يتم جمع الخرزات من خلال استخدام الرفوف المغناطيسية ، وغسلها عدة مرات لشطف أي كروماتين أو أجسام مضادة غير مرتبطة.
لتحرير الكروماتين منها ، توضع الخرزات في محلول يحتوي على المنظفات SDS ، وبعد جمع الخرزات بمغناطيس ، يتم الاحتفاظ بالمادة الطافية. ثم يضاف إنزيم بروتيناز K إلى هذا المحلول لتحلل جميع البروتينات ، بما في ذلك الهستونات ، بحيث يمكن عزل مكون الحمض النووي للكروماتين. ثم يتم تنقية الحمض النووي الناتج وتحليله.
دعنا الآن نلقي نظرة على كيفية استخدام العلماء حاليا ل ChIP في مختبراتهم.
يستخدم العديد من الباحثين ChIP لتقييم التغييرات في تعديلات الهيستون الناتجة عن الإشارات خارج الخلية. هنا ، تمت معالجة الخلايا البشرية المستنبتة بسيتوكين معين ، أو جزيء إشارات ، وتم تقييم التغيرات في مثيلة الهيستون. من خلال فحص ChIP DNA باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي ، قرر الباحثون أنه - استجابة للعلاج - اكتسب جين ترميز عامل النسخ IRF1 علامة هيستون منشطة ، H3K36me3. مكن هذا التعديل كلا من البروتين التنظيمي وبوليميراز الحمض النووي الريبي II من الارتباط ب IRF1 ، مما أدى إلى نسخه.
يمكن أيضا استخدام ChIP لاكتساب نظرة ثاقبة للتغيرات في التعبير الجيني التي تحدث أثناء إصابة الأنسجة وتجديدها. في هذه التجربة ، أتلف الباحثون أحد مكونات الجهاز العصبي المحيطي في الفئران - العصب الوركي - ثم استخدموا ChIP للبحث عن تفاعلات جديدة بين البروتين الحمض النووي في هياكل الجهاز العصبي المحيطي الأخرى ، مثل العقد التي تحيط بالحبل الشوكي. خلص العلماء إلى أنه بعد إصابة الأعصاب ، أصبح بروتين p53 ، وهو منظم لإصلاح الحمض النووي ، مرتبطا بجين متورط في تجديد الأنسجة ، GAP43 .
أخيرا ، يعمل بعض العلماء على تبسيط إجراءات ChIP لزيادة إنتاجية التجارب وكفاءتها. هنا ، تمكن الباحثون من "أتمتة" ChIP ، مما يجعل الآلة تؤدي العديد من الخطوات في البروتوكول. سمح ذلك للباحثين بتقييم الحمض النووي المرتبط بالعديد من تعديلات الهيستون المختلفة في وقت واحد ، باستخدام عدد صغير نسبيا من الخلايا - 10,000 - مما أدى إلى نتائج مشابهة لتلك التي شوهدت بأعداد خلايا أكبر ، أو مع تقنيات ChIP "اليدوية" القياسية.
لقد شاهدت للتو فيديو JoVE حول ترسيب الكروماتين المناعي. في هذا الفيديو، ناقشنا كيف يشكل الحمض النووي والبروتينات معا الكروماتين، وخطوات بروتوكول، يسمى ChIP، والذي يمكن استخدامه لتحديد تسلسلات الحمض النووي المرتبطة بحالات أو بروتينات كروماتين معينة. استكشفنا أيضا كيف يستخدم الباحثون ChIP ويعدله لفهم دور تفاعلات الحمض النووي والبروتين أثناء تنظيم الجينات بشكل أفضل. كما هو الحال دائما ، شكرا على المشاهدة!
تسجيل الدخول أو للوصول إلى المحتوى الكامل. تعرّف على المزيد حول وصول مؤسستك إلى محتوى JoVE هنا
ترسيب مناعي الكروماتين ، أو "ChIP" ، هو تقنية يستخدمها الباحثون لتقييم تفاعلات البروتين والحمض النووي. تلعب عوامل البروتين أدوارا مهمة في تنظيم الجينات. فهي لا تنظم الحمض النووي في الكروموسومات فحسب ، بل ترتبط أيضا بتسلسلات محددة من الحمض النووي - تسمى المواقع التنظيمية - لتنشيط أو قمع التعبير. أثناء ChIP ، يكون الكروماتين - الذي يتكون من الحمض النووي والبروتينات المرتبطة به - "مترسبا مناعيا" ، مما يعني أنه معزول من خلال استخدام الأجسام المضادة. باستخدام هذه الطريقة ، يمكن للباحثين تقييم البروتينات المرتبطة بتسلسل الحمض النووي.
في هذا الفيديو ، سنراجع تعديلات الكروماتين وأدوارها في التنظيم اللاجيني ، وكيف يمكن ل ChIP فحص هذه التعديلات. سنصف بعد ذلك إجراء معمما لهذه التقنية ، وأخيرا نناقش كيفية استخدام العلماء ل ChIP في البحث اليوم.
لنبدأ بمراجعة ماهية تعديلات الكروماتين ، وكيفية دراستها باستخدام ChIP.
في حقيقيات النوى ، يتم تخزين الحمض النووي في النوى عن طريق "لف" حول مجمعات البروتين. هذه البروتينات عبارة عن هيستونات ، ويشار إلى كل مركب هيستون ملفوف بالحمض النووي باسم "النيوكليوسوم". يتم تنظيم التعبير الجيني عن طريق "شغل النيوكليوسوم" ، أو ما إذا كان امتداد الحمض النووي معبأ في النيوكليوسومات. يميل الحمض النووي المنسوخ إلى أن يكون موجودا في مناطق "خالية من النيوكليوسوم" ، مما يسمح للبروتينات بالارتباط بالمواقع التنظيمية للجين ، وتمكين بوليميراز الحمض النووي الريبي من إجراء النسخ.
تشير الأدلة الحالية إلى أن التغييرات في بنية الكروماتين التي تنظم التعبير الجيني يتم التوسط فيها عن طريق التعديلات الكيميائية التي يتم إجراؤها على الهستونات ، عادة في "ذيولها" التي تتحرك بحرية. أكثرها شيوعا هي مجموعات الأسيتيل والميثيل والفوسفات التي تتم إضافتها إلى أو إزالة الأحماض الأمينية المحددة ، ويلاحظ أن هذه التعديلات المختلفة في هيستون مرتبطة بمستويات أو أنماط مختلفة من التعبير الجيني.
على سبيل المثال ، تم ربط إضافة ثلاث مجموعات ميثيل إلى بقايا اللايسين السابعة والعشرين في وحدة هيستون الفرعية H3 - وهو تعديل يسمى H3K27me3 - بإسكات الجينات. بدلا من ذلك ، ارتبط تعديل H3K9ac ، حيث تتم إضافة مجموعة الأسيتيل إلى بقايا اللايسين التاسعة على هيستون H3 ، بتنشيط الجينات.
يفترض أن تعديلات هيستون تلعب دورا في التنظيم اللاجيني للتعبير الجيني عن طريق تمييز مناطق الكروماتين على أنها "نشطة" أو "صامتة". تتمثل إحدى الآليات التي يعتقد من خلالها أن تعديلات الهيستون تمارس آثارها في تجنيد عوامل النسخ أو إنزيمات "إعادة تشكيل" الكروماتين ، والتي تحرك الأخيرة فعليا مواضع النيوكليوسومات.
باستخدام ChIP ، يمكن استهداف تعديلات هيستون محددة بواسطة الأجسام المضادة ، والتي يمكن "سحبها" جنبا إلى جنب مع الحمض النووي المحيط. يمكن للباحثين بعد ذلك استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل أو المصفوفات الدقيقة أو التسلسل لتحديد مناطق الحمض النووي المرتبطة بتعديلات الهيستون ذات الأهمية. من خلال تغيير الأجسام المضادة المستخدمة أثناء ChIP ، يمكن أن تساعد هذه التقنية أيضا في تحديد مناطق الحمض النووي المرتبطة بعوامل النسخ والبروتينات التنظيمية الأخرى.
الآن بعد أن تعرفت على المبادئ الكامنة وراء ChIP ، دعنا ننتقل إلى إجراء معمم لهذه التقنية.
للبدء ، يتم جمع الخلايا ذات الأهمية ومعالجتها بمواد كيميائية مثل الفورمالديهايد ، والتي تعمل ككواشف "متقاطعة" وتساعد في لصق البروتينات على تسلسل الحمض النووي الذي ترتبط به من خلال تسهيل تكوين الروابط التساهمية بينهما. يجب توخي الحذر حتى لا "الإفراط في معالجة" الخلايا بالفورمالديهايد ، لأن هذا يمكن أن يؤثر على قدرة الأجسام المضادة على التعرف على تعديلات الهيستون المستهدفة في مراحل ChIP اللاحقة. لإيقاف عملية الربط المتقاطع ، يضاف الجلايسين إلى محلول الفورمالديهايد الذي تتم معالجة الخلايا به. ثم يتم جمع الخلايا وتحللها لإطلاق الكروماتين.
لإذابة الكروماتين وتحديد مناطق الحمض النووي التي ترتبط بالهيستونات المعدلة بدقة ، يتم "قص" الكروماتين ميكانيكيا إلى قطع أصغر باستخدام الموجات الصوتية - وهي عملية تسمى الصوتنة. عادة ، يهدف العلماء إلى إنشاء شظايا كروماتين يتراوح طولها من 200 إلى 1000 زوج أساسي. بمجرد إنشاء شظايا كروماتين بالحجم المطلوب ، يضاف جسم مضاد إلى المحلول ، ويتم تحضين الخليط لإعطاء الجسم المضاد وقتا للتعرف على تعديل هيستون المستهدف.
ثم يتم إدخال الخرز المغناطيسي الذي يمكن أن ترتبط به الأجسام المضادة في الخليط ، مما يؤدي إلى شل حركة مجمعات الكروماتين المرتبطة بالأجسام المضادة. يتم جمع الخرزات من خلال استخدام الرفوف المغناطيسية ، وغسلها عدة مرات لشطف أي كروماتين أو أجسام مضادة غير مرتبطة.
لتحرير الكروماتين منها ، توضع الخرزات في محلول يحتوي على المنظفات SDS ، وبعد جمع الخرزات بمغناطيس ، يتم الاحتفاظ بالمادة الطافية. ثم يضاف إنزيم بروتيناز K إلى هذا المحلول لتحلل جميع البروتينات ، بما في ذلك الهستونات ، بحيث يمكن عزل مكون الحمض النووي للكروماتين. ثم يتم تنقية الحمض النووي الناتج وتحليله.
دعنا الآن نلقي نظرة على كيفية استخدام العلماء حاليا ل ChIP في مختبراتهم.
يستخدم العديد من الباحثين ChIP لتقييم التغييرات في تعديلات الهيستون الناتجة عن الإشارات خارج الخلية. هنا ، تمت معالجة الخلايا البشرية المستنبتة بسيتوكين معين ، أو جزيء إشارات ، وتم تقييم التغيرات في مثيلة الهيستون. من خلال فحص ChIP DNA باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي ، قرر الباحثون أنه - استجابة للعلاج - اكتسب جين ترميز عامل النسخ IRF1 علامة هيستون منشطة ، H3K36me3. مكن هذا التعديل كلا من البروتين التنظيمي وبوليميراز الحمض النووي الريبي II من الارتباط ب IRF1 ، مما أدى إلى نسخه.
يمكن أيضا استخدام ChIP لاكتساب نظرة ثاقبة للتغيرات في التعبير الجيني التي تحدث أثناء إصابة الأنسجة وتجديدها. في هذه التجربة ، أتلف الباحثون أحد مكونات الجهاز العصبي المحيطي في الفئران - العصب الوركي - ثم استخدموا ChIP للبحث عن تفاعلات جديدة بين البروتين الحمض النووي في هياكل الجهاز العصبي المحيطي الأخرى ، مثل العقد التي تحيط بالحبل الشوكي. خلص العلماء إلى أنه بعد إصابة الأعصاب ، أصبح بروتين p53 ، وهو منظم لإصلاح الحمض النووي ، مرتبطا بجين متورط في تجديد الأنسجة ، GAP43 .
أخيرا ، يعمل بعض العلماء على تبسيط إجراءات ChIP لزيادة إنتاجية التجارب وكفاءتها. هنا ، تمكن الباحثون من "أتمتة" ChIP ، مما يجعل الآلة تؤدي العديد من الخطوات في البروتوكول. سمح ذلك للباحثين بتقييم الحمض النووي المرتبط بالعديد من تعديلات الهيستون المختلفة في وقت واحد ، باستخدام عدد صغير نسبيا من الخلايا - 10,000 - مما أدى إلى نتائج مشابهة لتلك التي شوهدت بأعداد خلايا أكبر ، أو مع تقنيات ChIP "اليدوية" القياسية.
لقد شاهدت للتو فيديو JoVE حول ترسيب الكروماتين المناعي. في هذا الفيديو، ناقشنا كيف يشكل الحمض النووي والبروتينات معا الكروماتين، وخطوات بروتوكول، يسمى ChIP، والذي يمكن استخدامه لتحديد تسلسلات الحمض النووي المرتبطة بحالات أو بروتينات كروماتين معينة. استكشفنا أيضا كيف يستخدم الباحثون ChIP ويعدله لفهم دور تفاعلات الحمض النووي والبروتين أثناء تنظيم الجينات بشكل أفضل. كما هو الحال دائما ، شكرا على المشاهدة!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What are histone modifications and how do they affect gene expression?
Histone modifications are chemical changes—such as acetyl, methyl, or phosphate groups—added to histone proteins that regulate gene expression. H3K27me3 marks genes for silencing, while H3K9ac marks genes for activation. These modifications recruit transcription factors and chromatin remodeling enzymes, controlling whether DNA regions remain active or silent in the cell.
Q2: How does chromatin immunoprecipitation isolate protein-DNA interactions?
ChIP uses antibodies to target specific histone modifications or proteins bound to DNA. Cross-linking reagents like formaldehyde fix proteins to DNA, then chromatin is sheared into fragments. Antibodies bind their targets, magnetic beads capture the antibody-protein-DNA complexes, and after washing and protein degradation, the associated DNA is purified and analyzed.
Q3: What is the purpose of sonication in the ChIP protocol?
Sonication uses sound waves to mechanically shear chromatin into smaller, defined fragments typically 200 to 1000 base pairs long. This step solubilizes chromatin and precisely defines the DNA regions associated with modified histones, enabling accurate antibody targeting and improving the specificity of protein-DNA interaction detection.
Q4: How do researchers analyze ChIP results to identify gene regulatory regions?
After isolating ChIP DNA, researchers employ detection and quantification of nucleic acids by real time PCR, microarrays, or sequencing to identify which DNA regions associate with specific histone modifications or regulatory proteins. Real-time PCR provides quantitative data on gene-specific changes, while sequencing reveals genome-wide binding patterns.
Q5: Why is cross-linking important in chromatin immunoprecipitation?
Cross-linking reagents like formaldehyde create covalent bonds between proteins and DNA, fixing them together before cell lysis. This preserves transient protein-DNA interactions that would otherwise dissociate. However, over-treatment with formaldehyde can impair antibody recognition of target histone modifications, so careful optimization is essential.
Q6: What research applications use ChIP to study gene regulation?
Researchers use ChIP to evaluate histone modification changes triggered by signaling molecules, track DNA-protein interactions during tissue regeneration, and identify novel regulatory mechanisms. For example, ChIP revealed that the p53 protein associates with regeneration genes after nerve injury, and automated ChIP streamlines high-throughput analysis of multiple histone modifications simultaneously.
Q7: How does nucleosome occupancy influence gene expression and chromatin structure?
Transcribed genes typically occupy nucleosome-free regions that allow regulatory proteins and RNA polymerase to access DNA sequences. Histone modifications regulate whether nucleosomes remain tightly packed—silencing genes—or are repositioned by chromatin remodeling enzymes to expose regulatory sites and enable transcription and gene activation.
Browse More Videos
الفصول في هذا الفيديو
0:00
Overview
1:07
Chromatin Modifications and ChIP
3:46
Generalized ChIP Procedure
5:51
Applications
7:58
Summary