النهج القائم على الطيف، جنبا إلى جنب السائل اللوني الكتلة لتحليل المستقلب من

الهدف العام من طريقة أخذ العينات هذه هو جمع عينات من المستقلبات من بكتيريا Staphyococcus aureus لإجراء تقدير كمي لاحق باستخدام تقنية Tandem Liquid Chromatography-Mass Spectrometry. يهتم مختبرنا بدراسة التقاطع بين عملية التمثيل الغذائي والنشوء المرضي في البكتيريا ذات الصلة بصحة الإنسان. وفي الوقت الحالي، نستخدم الممرض البشري الانتهازي Staphylococcus aureus ككائن نموذجي.

إن أحد الأسئلة الرئيسية التي نسعى للإجابة عنها هو كيف تكيّف البكتيريا وظائفها الفسيولوجية وقدرتها الإمراضية عند مواجهة نقص المغذيات أثناء إصابة المضيف. وتكمن ميزة هذه التقنية في أنها توفر لمحة عن توزيع نواتج أيضية محددة عبر العديد من المسارات الأيضية في الخلايا التي تنمو بنشاط، مع إحداث أدنى قدر من الاضطراب في حالتها الفسيولوجية. للبدء، قم بتخطيط سلالات S.aureus المطلوبة لعزلها على طبق آجار صويا تريبتيك من المخزون الغليسيرولي المجمد.

قم بتحضين الخلايا عند درجة حرارة 37 °C لمدة تتراوح بين 16 و24 ساعة. وفي اليوم التالي، قم بتلقيح 4 mLs من مرق الصويا التريبتيكي، أو TSB، في أنابيب تحضين زجاجية معقمة باستخدام مستعمرات مفردة من كل سلالة. قم بتحضين المزارع، وهي مائلة مع التدوير، عند درجة حرارة 37 °C لمدة تتراوح بين 16 و20 ساعة.

استخدم مقياس الطيف الضوئي لقياس الكثافة الضوئية للمزارع عند 600 nanometers، والتي يُرمز لها اختصاراً بـ OD600. وبناءً على هذا القياس، قم بتخفيف الخلايا لتصل إلى OD600 بقيمة 0.05 في 50 mLs من وسط TSB المعقم، وذلك في دوارق Delong سعة 250 mL. حضن المزارع عند 37 degrees Celsius في حمام مائي دافئ مع الرج بسرعة 280 rpm.

قم بقياس OD600 كل 30 دقيقة. ومع زيادة الكثافة الضوئية، قد يصبح من الضروري تخفيف المزارع باستخدام TSB لضمان بقائها ضمن نطاق الامتصاص الخطي لجهاز spectrophotometer. وأثناء نمو الخلايا، قم بتحضير محاليل درء الاستخلاص حديثاً باستخدام كواشف ذات أعلى نقاوة متاحة كما هو موضح في البروتوكول النصي.

عندما تصل المزارع إلى قيمة OD600 تتراوح بين 0.8 و1.0، قم بنقلها إلى 50 mLs من وسط TSB الطازج والمسخن مسبقاً لتصل قيمة OD600 إلى 0.01 إلى 0.05، وكرر خطوات التحضين والقياس. جهز طبقة من الثلج الجاف المسحوق في وعاء مناسب، مثل طبق زجاجي أو دلو ثلج أو مبرد. ومع اقتراب الكثافات الضوئية للمزارع من نقطة الحصاد المطلوبة، أضف 1 mL من محلول الإخماد إلى طبق بتري غير معالج بقطر 35 mm، وقم بتبريده مسبقاً على الثلج الجاف لمدة 5 دقائق على الأقل.

لأغراضنا، تكون نقطة الحصاد المطلوبة عند كثافة ضوئية تبلغ حوالي 0.4 إلى 0.5. ولكن يمكن تغيير ذلك اعتماداً على الأهداف التجريبية. بعد ذلك، ضع قرص ترشيح من الفولاذ المقاوم للصدأ في سدادة مطاطية، وثبته فوق دورق تفريغ متصل بنظام تفريغ مركزي أو مضخة تفريغ.

قم بتطبيق الفراغ، وضع غشاءً من إستر السليلوز المختلط في الأعلى. استخدم مرشحاً بنفس قطر القرص الخزفي لضمان جمع كافة الخلايا. من الضروري جمع الخلايا وإيقاف النشاط الأيضي بأسرع وقت ممكن، وذلك لتقديم لقطة فورية للوفرات الأيضية تحت حالة معينة.

حتى التأخيرات القصيرة يمكن أن تؤثر على الفسيولوجيا في الحالة المستقرة للخلايا. عندما تتراوح قيمة OD600 بين 0.4 و0.5، استخدم ماصة سيرولوجية لسحب 13 mLs من المزرعة من الدورق. ضع العينة على المرشح فوراً.

بعد ترشيح العينة بأكملها، اغسل المرشح فوراً بما لا يزيد عن 5 mL من محلول PBS المبرد بالثلج لإزالة المستقلبات المرتبطة بالوسط. بعد ذلك، افصل vacuum واستخدم ملقطاً معقماً لإزالة المرشح من frit. اقلب المرشح في محلول quench المبرد مسبقاً.

يُحضن المرشح في محلول الإخماد (quench solution) فوق الثلج الجاف لمدة لا تقل عن 20 دقيقة. وباستخدام ملاقط معقمة، يُقلب المرشح في طبق بتري، ثم تُستخدم الماصة الدقيقة لشطف الخلايا من الغشاء إلى محلول الإخماد. تُعلق الخلايا مرة أخرى في محلول الإخماد، ثم يُنقل معلق الخلايا إلى أنبوب معقم سعة 2 mL مقاوم للصدمات يحتوي على 100 microliters تقريبًا من حبيبات السيليكا بحجم 0.1 mm.

يُحفظ هذا على الثلج الجاف أو في درجة حرارة 80- درجة مئوية. لبدء استخلاص المستقلبات، قم أولاً بإذابة العينات على الثلج الرطب. بعد ذلك، قم بتفتيت الخلايا في جهاز متجانس عبر أربع نبضات مدة كل منها 30 ثانية بسرعة 6000 rpm، مع فترات تبريد لمدة دقيقتين على الثلج الجاف بين الدورات.

قم بتصفية المستخلصات لمدة 15 دقيقة في أنبوب طرد مركزي مبرد مسبقاً في جهاز طرد مركزي دقيق وبأقصى سرعة. بعد عملية الطرد المركزي، انقل السائل الطافي إلى أنبوب طرد مركزي دقيق نظيف. وباستخدام ماصة دقيقة، انقل جزءاً صغيراً من العينة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق لتقدير كمية محتوى الببتيد المتبقي كما هو موضح في البروتوكول النصي.

يُحفظ المتبقي من العينة عند 80 درجة مئوية. يُرجى الرجوع إلى البروتوكول النصي لتحليل النواتج الأيضية عبر الكروماتوغرافيا السائلة ومطياف الكتلة. استُخدم الطافر المفقود لـ CodY لاستقصاء استنفاد الأحماض الأمينية متفرعة السلسلة، حيث يقوم بروتين CodY بتعديل تعبير عشرات الجينات استجابةً لانخفاض تركيز هذه العناصر الغذائية.

لا يملك طفرة codY إلا تأثير ضئيل على معدل نمو خلايا S.aureus. ويشير الانخفاض في الكثافة الضوئية عند علامة الثلاث ساعات إلى خطوة التخفيف العكسي، والتي تزيد من عدد تضاعفات الخلايا قبل الحصاد، وتعمل على تخفيف الجزيئات المختلفة التي تتراكم أثناء النمو طوال الليل. ويظهر تحليل تسلسل RNA للنسوخ في السلالتين تغيرات ملحوظة في تعبير الجينات المشاركة في تخليق عائلة الأحماض الأمينية للأسبارتات.

هنا، تشير الأرقام الموجودة أسفل أسماء الجينات إلى مقدار التغير في التعبير الجيني في طفرة codY null، مقارنة بالسلالة البرية. وبعد إجراء تقدير كمي للمستقلبات المستخلصة باستخدام LC-MS، تمت مقارنة الوفرة بين السلالتين. وبالتركيز على بعض المركبات المرتبطة بعائلة الأحماض الأمينية من نوع aspartate، يلاحظ انخفاض وفرة السلائف، مثل aspartate وO-acetylhomoserine، في طفرة codY.

وعلى العكس من ذلك، تزداد النواتج النهائية مثل threonine و isoleucine. وهنا، يشير الخط المتقطع إلى الحد الفاصل للتغيرات في الوفرة لهذه التجربة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخلاص النواتج الأيضية من Staphylococcus aureus لتقديرها كمياً عبر تقنية الكروماتوغرافيا السائلة مع مطياف الكتلة.

هذا البروتوكول مناسب أيضًا، مع إجراء بعض التعديلات، لجمع النواتج الأيضية من أنواع بكتيرية أخرى. ونظرًا لأن البكتيريا تستجيب للبيئات الديناميكية، فمن المهم تنفيذ خطوات الترشيح والغسل بسرعة لتقليل التغيرات الفسيولوجية المحتملة الناتجة عن عملية أخذ العينات. كما يمكن تقليل هذه التغيرات من خلال الحفاظ على برودة القرص الخزفي (frit) ومحلول PBS أثناء أخذ العينات.