A 5-ماك دوت بلوت الفحص تحديد مستوى الحمض النووي ميثيلاتيون من تشوندروسيت التفرق في المختبر
مايو 17, 2017
نقدم طريقة لقياس مثيلة الحمض النووي على أساس 5-ميثيلسيتوسين (5-مك) نقطة لطخة. لقد حددنا مستويات 5-مك خلال ديدفيرنتياتيون غضروفي. ويمكن استخدام هذه التقنية البسيطة لتحديد بسرعة النمط الظاهري غضروفي في علاج إسي.
الهدف العام من هذه التجربة هو تحديد مستويات 5-ميثيل سيتوزين أثناء تفكيك الخلايا الغضروفية. تظهر هذه الطريقة يمكن أن تساعد في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في علاج عيوب الغضروف الخلوية مثل زرع الخلايا الغضروفية الذاتية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها طريقة موثوقة وبسيطة وسريعة للكشف عن مستوى مثيلة الحمض النووي العام لتقييم النمط الظاهري للخلايا الغضروفية.
إن الآثار المترتبة على هذه التقنية قياسية لنصيبنا من زرع الخلايا الغضروفية الذاتية لأن مثيلة الحمض النووي أثناء تفكيك الخلايا الغضروفية هي عقبة رئيسية أمام علاج زرع الخلايا الغضروفية الذاتية لعيوب الغضروف. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لمستويات مثيلة الحمض النووي في تمايز الخلايا الغضروفية ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على دراسات أخرى للأمراض ، مثل هشاشة العظام. خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما قرأنا البروتوكولات في مراجع طريقة اللطخة النقطية.
يرجى إظهار أن عرض هذه الطريقة أمر بالغ الأهمية حيث يصعب تسمية حالات اللطخة النقطية. يجب تغيير طبيعة الحمض النووي الجيني ثم تخفيفه متسلسلا. ثم يتم دعمه على غشاء نايلون موجب الشحنة.
سيوضح الإجراءات Zhaofeng Jia ، طالب دراسات عليا من مختبرنا. تم عزل أنسجة الغضروف المفصلي المستخدمة في هذه الدراسة من مفاصل الركبة للمرضى المتبرعين بعد الصدمة. باستخدام مشرط معقم ، قم بتقطيع الغضروف إلى قطعة إلى ملليمتر مكعب.
ثم أضف ملليغراما واحدا لكل مليلتر من الكولاجيناز II و DMEM إلى الغضروف المفروم. وتحتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 12 إلى 16 ساعة لهضم الخلايا الغضروفية. في اليوم التالي ، قم بتصفية تعليق الخلية الناتج من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر.
قم بتدوير الخلايا. تخلص من المادة الطافية ، وأضف PBS ، ثم قم بالتدوير مرة أخرى. عد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم.
والبذور بكثافة 20 ، 000 إلى 30 ، 000 خلية لكل سنتيمتر مربع و DMEM مكمل ب 10٪ FBS و 1٪ بنسلين ستربتومايسين. استزراع في حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة. حصاد الخلايا الفرعية المتشاقة باستخدام 0.25٪ تريبسين EDTA.
وإعادة الطلاء بكثافة 6 ، 600 خلية لكل سنتيمتر مربع. استزراع الخلايا الغضروفية في طبقات أحادية لمدة تصل إلى ستة مقاطع وقم بتقييمها في المقاطع الأولى والثانية والثالثة والرابعة والخامسة. لبدء هذا الإجراء ، اجمع الخلايا عن طريق التربسين والطرد المركزي.
ثم أعد تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من محلول التحلل لكل 10 ملايين خلية عن طريق سحب العينات والانعكاس السريع. احتضان لمدة ساعة عند 37 درجة مئوية. أضف البروتيناز K بتركيز 160 ميكروغرام لكل مليلتر من محللة الخلية واقلب الخليط بقوة.
احتضان لمدة ست ساعات عند 55 درجة مئوية. أضف إلى كل عينة حجما واحدا من الفينول المشبع بدرجة الحموضة Tris 7.9 إلى الكلوروفورم إلى كحول الأيزواميل. رج العينة يدويا جيدا لمدة 20 ثانية تقريبا.
الطرد المركزي للعينات في درجة حرارة الغرفة عند 13 ، 000 مرة G لمدة خمس دقائق. قم بإزالة المرحلة المائية العلوية ، ونقل إلى أنبوب جديد. لإزالة الفينول ، أضف حجما متساويا من الكلوروفورم إلى كل أنبوب.
رجها باليد ، ثم تدور. انقل المرحلة المائية العلوية إلى أنبوب جديد. أضف 0.1 حجم عينة من ثلاثة أسيتات الصوديوم المولارية ، ودرجة الحموضة ثمانية ومجلدين من 100٪ إيثانول.
قم بتخزين الأنابيب عند سالب 20 درجة مئوية طوال الليل لترسيب الحمض النووي الجيني. في اليوم التالي ، قم بالطرد المركزي للعينات عند أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق عند 16،000 مرة G لتكسير الحمض النووي الجيني. اغسل العينات بنسبة 70٪ من الإيثانول.
وجهاز الطرد المركزي عند أربع درجات مئوية لمدة دقيقتين عند 13 ، 000 مرة G. قم بإزالة المادة الطافية بعناية وجفف حبيبات الحمض النووي في الهواء. أعد تعليق الحمض النووي في 10 مللي مولار ثلاثية الرقم الهيدروجيني ثمانية 0.1 مللي مولار EDTA. ابدأ هذا الإجراء عن طريق تغيير طبيعة الحمض النووي المعزول في هيدروكسيد الصوديوم 0.1 مولار لمدة 10 دقائق عند 95 درجة مئوية.
قم بتحييد الحمض النووي باستخدام أسيتات الأمونيوم المولية على الجليد. ثم خفف مرتين بالماء المقطر المزدوج. الخطوة الأكثر أهمية في فحوصات اللطخة النقطية هي اكتشاف العينات ، وتذكر القيام بذلك ببطء وبعناية.
حاول تصغير كل مصفوفة مرقطة إلى قطر ثلاثة إلى أربعة ملليمترات. باستخدام طرف ماصة ضيق الفم ، حدد بعناية ميكرولترين من الحمض النووي الجيني المخفف التسلسلي على غشاء نايلون موجب الشحنة في وسط الشبكة. امسح الغشاء عند 80 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
بعد ذلك ، قم بسد مواقع ربط الأجسام المضادة غير المحددة عن طريق نقع الغشاء في 5٪ BSA في TBST في طبق بتري 10 سم لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع رج لطيف. بعد ساعة واحدة ، اغسل الغشاء ثلاث مرات في TBST لمدة خمس دقائق في كل مرة. احتضان الغشاء بجسم مضاد أحادي النسيلة مضاد للفأر مضاد ل 5-methylcytosine في TBST عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها.
في اليوم التالي ، اغسل الغشاء ثلاث مرات في TBST لمدة خمس دقائق في كل مرة. ثم احتضان بجسم مضاد ثانوي ، بيروكسيداز الأغنام المترافق G الغلوبولين المناعي المضاد للفأر في TBST لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد غسل الغشاء في TBST كما كان من قبل ، أضف ركيزة الإنزيم إلى الغشاء واحتضن لمدة خمس إلى 10 دقائق.
أخيرا ، تصور إشارة الجسم المضاد الثانوي باستخدام مجموعة تلألؤ كيميائي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. أظهرت الخلايا الغضروفية المزروعة في طبقة أحادية حتى المقطع السادس تغيرات نمطية تدريجية أصبحت مضغوطة للغاية ومسطحة مع مقاطع متتالية. هذا التغيير في التشكل هو نموذجي لعملية تفكيك الخلايا الغضروفية.
تم عزل الحمض النووي الجيني من الخلايا الغضروفية بعد عدد مختلف من الممرات وتم تقييم مستويات مثيلة الحمض النووي بواسطة مقايسة لطخة نقطية محددة 5-Methylcytosine. ثم تم تحليل شدة النقاط بواسطة الصورة J. لوحظت مستويات ميثيل سيتوزين مرتفعة تدريجيا مع زراعة فرعية طويلة الأمد ، مما يشير إلى وجود ارتباط بين مستويات المثيلة المتزايدة بشكل عام وعدم تمايز الخلايا الغضروفية. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في غضون 24 ساعة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.
أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر زيادة تركيز الحمض النووي الجيني ونقائه. بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل توصيف مكينة الحمض النووي الجيني للإجابة على أسئلة إضافية مثل الخلايا الغضروفية لعدم التمايز في الزراعة الأحادية. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال زرع الخلايا الغضروفية الذاتية لتقييم مكينة الحمض النووي للخلايا الغضروفية وتحديد النمط الظاهري للخلايا الغضروفية في علاج عيوب الغضروف.
بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام لطخة نقطية 5-Methylcytosine للكشف عن ذراع المكائد المتدهور لتقييم النمط الظاهري للخلايا الغضروفية. لا تنس أن العمل مع الفينول يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب دائما ارتداء القفازات أثناء تنفيذ هذا الإجراء.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة طريقة لقياس مثيلة الحمض النووي من خلال تقنية 5-ميثيل سيتوزين (5-مC) نقطة النقط. تركز على تحديد مستويات 5-مC خلال إزالة التمايز للخلايا الغضروفية، وهو أمر حاسم لعلاج زراعة الخلايا الغضروفية الذاتية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الخلية
- الطب التجديدي
الخلفية
- إزالة تمايز الخلايا الغضروفية تشكل تحديات في إصلاح الغضاريف.
- مثيلة الحمض النووي هي عامل رئيسي يؤثر على شكل الخلايا الغضروفية.
- فهم المثيلة يمكن أن يحسن نتائج العلاج لعيوب الغضاريف.
- يمكن أيضًا تطبيق هذه الطريقة على أمراض أخرى، مثل هشاشة العظام.
هدف الدراسة
- لقياس مستويات 5-مC خلال إزالة تمايز الخلايا الغضروفية.
- لتطوير طريقة موثوقة لتقييم شكل الخلايا الغضروفية.
- لمعالجة العوائق في زراعة الخلايا الغضروفية الذاتية.
الطرق المستخدمة
- تقنية 5-ميثيل سيتوزين (5-مC) نقطة النقط.
- تقييم مستويات مثيلة الحمض النووي.
- تقييم شكل الخلايا الغضروفية خلال إزالة التمايز.
- تطبيق النتائج على علاجات عيوب الغضاريف.
النتائج الرئيسية
- الطريقة تكشف بشكل موثوق عن مستويات عامة لمثيلة الحمض النووي.
- مستويات 5-مC ترتبط بشكل الخلايا الغضروفية.
- الرؤى المكتسبة يمكن أن تحسن استراتيجيات زراعة الخلايا الغضروفية الذاتية.
- التطبيقات المحتملة تمتد إلى أمراض أخرى ذات صلة.
الاستنتاجات
- تقدم هذه التقنية نهجًا بسيطًا وسريعًا لتقييم مثيلة الحمض النووي.
- فهم ديناميكيات المثيلة أمر حاسم لتحسين علاجات إصلاح الغضاريف.
- يمكن أن تسهل الطريقة المزيد من الأبحاث في الطب التجديدي.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Chondrocyte dedifferentiation during in vitro expansion poses a significant challenge for autologous chondrocyte implantation, a key cartilage defect treatment. Global DNA methylation levels serve as a biomarker for phenotypic loss, yet existing quantification methods are hampered by high sample requirements, cost, or complexity. The 5-mC dot blot assay offers a reliable, simple, and rapid alternative to assess methylation dynamics, supporting early-stage target validation and mechanistic de-risking in regenerative medicine pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of epigenetic mechanisms driving chondrocyte phenotype loss during dedifferentiation.
- Operational Value: Provides a rapid readout for assessing global DNA methylation as a functional biomarker in target validation workflows.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by linking methylation trends to dedifferentiation progression, informing go/no-go decisions in cell therapy development.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative methylation data from serially diluted gDNA samples, enabling dose-response assessment across passage numbers.
- Operational Value: Uses a commercially available 5-mC antibody and nylon membrane, standardizing detection and reducing variability in epigenetic screening assays.
- Scalability Value: Eliminates need for gel electrophoresis or DNA digestion, accelerating assay setup and supporting medium-throughput evaluation of chondrocyte cultures.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Connects in vitro dedifferentiation models to phenotypic outcomes relevant to autologous chondrocyte implantation efficacy.
- Preclinical Value: Enables longitudinal monitoring of epigenetic changes across passages, supporting risk-adjusted advancement decisions in preclinical cell therapy studies.
- Mechanistic Value: Facilitates biomarker alignment by correlating 5-mC levels with dedifferentiation phenotypes, enhancing predictive confidence in translational models.
Pipeline & Workflow Integration
The 5-mC dot blot assay fits within the discovery-to-preclinical continuum by providing an epigenetic readout that informs target validation, assay readiness, and translational continuity in chondrocyte-based therapies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of epigenetic drivers in dedifferentiation, enabling pathway clarification and biological de-risking.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative methylation outputs from serially spotted gDNA, supporting assay standardization and compound or condition comparison.
- Analytics: Generates signal intensity data analyzable via image quantification, offering measurable readouts for evaluating methylation trends across experimental conditions.
- Translational Research: Bridges in vitro dedifferentiation models to phenotypic outcomes relevant to cartilage repair, supporting biomarker-aligned preclinical validation.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable epigenetic screening tool applicable beyond chondrocytes to other disease models involving phenotype stability, such as osteoarthritis.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity around epigenetic contributions to dedifferentiation.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through a simple dot blot format requiring minimal equipment and no DNA digestion.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling rapid epigenetic assessment early in discovery, reducing late-stage attrition due to unanticipated phenotypic instability.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of cell lines or culture conditions based on methylation stability, informing advancement decisions in regenerative medicine pipelines.
Implementation Considerations
- Requires expertise in genomic DNA isolation, denaturation, and blotting techniques to ensure sample integrity and signal accuracy.
- Dependent on access to hybridization ovens, chemiluminescence imaging systems, and standard molecular biology reagents (e.g., BSA, TBST, antibodies).
- Necessitates standardization of spotting technique and membrane handling to minimize variability in dot size and signal intensity across users and labs.
- Requires optimization of antibody incubation and washing conditions to reduce background and ensure specific detection of 5-mC across diverse gDNA samples.
- Limited to semi-quantitative or relative methylation assessment; absolute quantification may require complementary methods for validation.
![إيمونوستينينج لإدخال تعديلات على الحمض النووي: التحليل الحسابي للصور [كنفوكل]](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F56318.jpg%3Fv%3D2026-07-04T00%253A36%253A01.000Z&w=384&q=75)
