A 5-ماك دوت بلوت الفحص تحديد مستوى الحمض النووي ميثيلاتيون من تشوندروسيت التفرق في المختبر

الهدف العام من هذه التجربة هو تحديد مستويات 5-ميثيل سيتوزين أثناء تفكيك الخلايا الغضروفية. تظهر هذه الطريقة يمكن أن تساعد في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في علاج عيوب الغضروف الخلوية مثل زرع الخلايا الغضروفية الذاتية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها طريقة موثوقة وبسيطة وسريعة للكشف عن مستوى مثيلة الحمض النووي العام لتقييم النمط الظاهري للخلايا الغضروفية.

إن الآثار المترتبة على هذه التقنية قياسية لنصيبنا من زرع الخلايا الغضروفية الذاتية لأن مثيلة الحمض النووي أثناء تفكيك الخلايا الغضروفية هي عقبة رئيسية أمام علاج زرع الخلايا الغضروفية الذاتية لعيوب الغضروف. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لمستويات مثيلة الحمض النووي في تمايز الخلايا الغضروفية ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على دراسات أخرى للأمراض ، مثل هشاشة العظام. خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما قرأنا البروتوكولات في مراجع طريقة اللطخة النقطية.

يرجى إظهار أن عرض هذه الطريقة أمر بالغ الأهمية حيث يصعب تسمية حالات اللطخة النقطية. يجب تغيير طبيعة الحمض النووي الجيني ثم تخفيفه متسلسلا. ثم يتم دعمه على غشاء نايلون موجب الشحنة.

سيوضح الإجراءات Zhaofeng Jia ، طالب دراسات عليا من مختبرنا. تم عزل أنسجة الغضروف المفصلي المستخدمة في هذه الدراسة من مفاصل الركبة للمرضى المتبرعين بعد الصدمة. باستخدام مشرط معقم ، قم بتقطيع الغضروف إلى قطعة إلى ملليمتر مكعب.

ثم أضف ملليغراما واحدا لكل مليلتر من الكولاجيناز II و DMEM إلى الغضروف المفروم. وتحتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 12 إلى 16 ساعة لهضم الخلايا الغضروفية. في اليوم التالي ، قم بتصفية تعليق الخلية الناتج من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر.

قم بتدوير الخلايا. تخلص من المادة الطافية ، وأضف PBS ، ثم قم بالتدوير مرة أخرى. عد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم.

والبذور بكثافة 20 ، 000 إلى 30 ، 000 خلية لكل سنتيمتر مربع و DMEM مكمل ب 10٪ FBS و 1٪ بنسلين ستربتومايسين. استزراع في حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة. حصاد الخلايا الفرعية المتشاقة باستخدام 0.25٪ تريبسين EDTA.

وإعادة الطلاء بكثافة 6 ، 600 خلية لكل سنتيمتر مربع. استزراع الخلايا الغضروفية في طبقات أحادية لمدة تصل إلى ستة مقاطع وقم بتقييمها في المقاطع الأولى والثانية والثالثة والرابعة والخامسة. لبدء هذا الإجراء ، اجمع الخلايا عن طريق التربسين والطرد المركزي.

ثم أعد تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من محلول التحلل لكل 10 ملايين خلية عن طريق سحب العينات والانعكاس السريع. احتضان لمدة ساعة عند 37 درجة مئوية. أضف البروتيناز K بتركيز 160 ميكروغرام لكل مليلتر من محللة الخلية واقلب الخليط بقوة.

احتضان لمدة ست ساعات عند 55 درجة مئوية. أضف إلى كل عينة حجما واحدا من الفينول المشبع بدرجة الحموضة Tris 7.9 إلى الكلوروفورم إلى كحول الأيزواميل. رج العينة يدويا جيدا لمدة 20 ثانية تقريبا.

الطرد المركزي للعينات في درجة حرارة الغرفة عند 13 ، 000 مرة G لمدة خمس دقائق. قم بإزالة المرحلة المائية العلوية ، ونقل إلى أنبوب جديد. لإزالة الفينول ، أضف حجما متساويا من الكلوروفورم إلى كل أنبوب.

رجها باليد ، ثم تدور. انقل المرحلة المائية العلوية إلى أنبوب جديد. أضف 0.1 حجم عينة من ثلاثة أسيتات الصوديوم المولارية ، ودرجة الحموضة ثمانية ومجلدين من 100٪ إيثانول.

قم بتخزين الأنابيب عند سالب 20 درجة مئوية طوال الليل لترسيب الحمض النووي الجيني. في اليوم التالي ، قم بالطرد المركزي للعينات عند أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق عند 16،000 مرة G لتكسير الحمض النووي الجيني. اغسل العينات بنسبة 70٪ من الإيثانول.

وجهاز الطرد المركزي عند أربع درجات مئوية لمدة دقيقتين عند 13 ، 000 مرة G. قم بإزالة المادة الطافية بعناية وجفف حبيبات الحمض النووي في الهواء. أعد تعليق الحمض النووي في 10 مللي مولار ثلاثية الرقم الهيدروجيني ثمانية 0.1 مللي مولار EDTA. ابدأ هذا الإجراء عن طريق تغيير طبيعة الحمض النووي المعزول في هيدروكسيد الصوديوم 0.1 مولار لمدة 10 دقائق عند 95 درجة مئوية.

قم بتحييد الحمض النووي باستخدام أسيتات الأمونيوم المولية على الجليد. ثم خفف مرتين بالماء المقطر المزدوج. الخطوة الأكثر أهمية في فحوصات اللطخة النقطية هي اكتشاف العينات ، وتذكر القيام بذلك ببطء وبعناية.

حاول تصغير كل مصفوفة مرقطة إلى قطر ثلاثة إلى أربعة ملليمترات. باستخدام طرف ماصة ضيق الفم ، حدد بعناية ميكرولترين من الحمض النووي الجيني المخفف التسلسلي على غشاء نايلون موجب الشحنة في وسط الشبكة. امسح الغشاء عند 80 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.

بعد ذلك ، قم بسد مواقع ربط الأجسام المضادة غير المحددة عن طريق نقع الغشاء في 5٪ BSA في TBST في طبق بتري 10 سم لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع رج لطيف. بعد ساعة واحدة ، اغسل الغشاء ثلاث مرات في TBST لمدة خمس دقائق في كل مرة. احتضان الغشاء بجسم مضاد أحادي النسيلة مضاد للفأر مضاد ل 5-methylcytosine في TBST عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها.

في اليوم التالي ، اغسل الغشاء ثلاث مرات في TBST لمدة خمس دقائق في كل مرة. ثم احتضان بجسم مضاد ثانوي ، بيروكسيداز الأغنام المترافق G الغلوبولين المناعي المضاد للفأر في TBST لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد غسل الغشاء في TBST كما كان من قبل ، أضف ركيزة الإنزيم إلى الغشاء واحتضن لمدة خمس إلى 10 دقائق.

أخيرا ، تصور إشارة الجسم المضاد الثانوي باستخدام مجموعة تلألؤ كيميائي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. أظهرت الخلايا الغضروفية المزروعة في طبقة أحادية حتى المقطع السادس تغيرات نمطية تدريجية أصبحت مضغوطة للغاية ومسطحة مع مقاطع متتالية. هذا التغيير في التشكل هو نموذجي لعملية تفكيك الخلايا الغضروفية.

تم عزل الحمض النووي الجيني من الخلايا الغضروفية بعد عدد مختلف من الممرات وتم تقييم مستويات مثيلة الحمض النووي بواسطة مقايسة لطخة نقطية محددة 5-Methylcytosine. ثم تم تحليل شدة النقاط بواسطة الصورة J. لوحظت مستويات ميثيل سيتوزين مرتفعة تدريجيا مع زراعة فرعية طويلة الأمد ، مما يشير إلى وجود ارتباط بين مستويات المثيلة المتزايدة بشكل عام وعدم تمايز الخلايا الغضروفية. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في غضون 24 ساعة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر زيادة تركيز الحمض النووي الجيني ونقائه. بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل توصيف مكينة الحمض النووي الجيني للإجابة على أسئلة إضافية مثل الخلايا الغضروفية لعدم التمايز في الزراعة الأحادية. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال زرع الخلايا الغضروفية الذاتية لتقييم مكينة الحمض النووي للخلايا الغضروفية وتحديد النمط الظاهري للخلايا الغضروفية في علاج عيوب الغضروف.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام لطخة نقطية 5-Methylcytosine للكشف عن ذراع المكائد المتدهور لتقييم النمط الظاهري للخلايا الغضروفية. لا تنس أن العمل مع الفينول يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب دائما ارتداء القفازات أثناء تنفيذ هذا الإجراء.