متعدد الطبقات الكالسيوم الكالسيوم ²⁺ التصوير في الفئران تتحرك بحرية مع تحقيقات بريزم والمصور المجهري مضان

الهدف العام من هذا الإجراء هو السماح بالتصور المتزامن للنشاط العصبي عبر طبقات متعددة من الخلايا العصبية القشرية باستخدام مؤشرات الكالسيوم في فأر يتصرف بحرية وفهم عمل الدائرة العصبية باستخدام مجهر فلوري مصغر مثبت على الرأس. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأعصاب للأنظمة مثل ، كيف يتم نشر المعلومات عبر طبقات متعددة من القشرة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح للمرء بتصور مجموعات كبيرة من الخلايا العصبية المشفرة وراثيا عبر طبقات قشرية متعددة في تتصرف بحرية ، بشكل موثوق بمرور الوقت.

من أجل تصور الخلايا العصبية المشفرة وراثيا من طبقات قشرية متعددة في يتصرف بحرية ، يجب تنفيذ الإجراءات التالية ، ويسلط هذا البروتوكول الضوء على زرع مسبار المنشور ، وتركيب الصفيحة الأساسية والتصوير في الجسم الحي في فأر يتصرف بحرية. لبدء هذا الإجراء ، بعد أسبوع إلى أسبوعين من حقن الفيروس ، ضع في الجهاز التجسيمي ، واستعد لجراحة زرع مسبار المنشور ، عن طريق تطهيره بنسبة 70٪ من الإيثانول وتنظيفه بورق العدسة. بعد ذلك ، افتح حج القحف الدائري ، باستخدام مثقاب صغير مع لدغ 0.5 ملم.

تأكد من أن قطر حج القحف أكبر بقليل من قطر المنشور. بعد ذلك ، ضع حج القحف بحيث عندما يتم إدخال المنشور في القشرة ، تكون حافته المسطحة مواجهة لموقع حقن الفيروس وتكون ضمن دائرة نصف قطرها 150 إلى 200 ميكرون. بعد ذلك ، قم بإزالة الجافية بالملقط الناعم.

حافظ دائما على رطوبة الأنسجة باستخدام محلول ملحي معقم ، بمجرد تعرض أنسجة المخ. سيؤدي ذلك أيضا إلى الحفاظ على الضغط على الأنسجة. لتخفيف الضغط في أنسجة المخ أثناء إدخال مسبار المنشور ، قم بإنشاء مسار إدخال عن طريق ربط سكين تشريح ذو حواف مستقيمة بذراع حامل القطب الكهربائي للجهاز التجسيمي.

قم بتثبيته بزاوية ، بحيث تكون لوحة السكين عمودية على انحناء الجمجمة وفي مستوى مواز لعمود حقن الفيروس. ضع السكين بحذر فوق حج القحف ، على طول حافة الوسائط الداخلية وحوالي 200 ميكرون جانبيا لموقع حقن الفيروس مع توجيه حافة القطع للخلف. قم بتصفير المحور Z عندما يلامس طرف السكين البيات.

ثم قم بخفضه تدريجيا إلى عمق سيتم إدخاله في مسبار المنشور. بعد ذلك ، حرك السكين ملليمترا واحدا للخلف ، لإنشاء مسار للحافة الأمامية للمنشور. اسحب السكين ببطء باستخدام أداة المعالجة الدقيقة للذراع التجسيمية بزيادات قدرها 10 ميكرون في الثانية ، وضع قطعة من إسفنجة رغوة الجل مبللة بمحلول ملحي معقم فوق الشق.

بعد ذلك ، قم بتوصيل حامل العدسة بذراع مناور التجسيم بنفس زاوية السكين في الخطوة السابقة. قم بمحاذاة المنشور بحيث يكون الجانب المسطح من المنشور فوق الشق ومواز لعمود حقن الفيروس. بمجرد أن يصبح المنشور في الزاوية الصحيحة ، قم بخفضه تدريجيا في الدماغ بزيادات قدرها 10 ميكرون إلى مستوى Z النهائي البالغ 1.1 ملم من سطح الدماغ ، لهذا المسبار.

قم بتغطية أي نسيج مكشوف حول المنشور في حج القحف ، بمستوى وقائي رقيق جدا من مادة لاصقة مطاطية ، باستخدام إبرة قياس 25. لمنع العدسة من التحرك داخل حج القحف ، بعد معالجة المادة اللاصقة المطاطية ، استخدم إبرة قياس 25 لتطبيق بعض المواد اللاصقة cyanoacrylate لربط زجاج عدسة المنشور ، بالجمجمة المجاورة فوق طبقة لاصق المطاط الصناعي. بمجرد معالجة المادة اللاصقة cyanoacrylate ، قم بفك حامل العدسة وإزالة المجهر بعناية.

بعد ذلك ، اسحب ذراع مناور التجسيم ببطء ، لترك مسبار المنشور مزروعا بإحكام. ضع طبقة من لاصق أكريليك الأسنان أو السيانوا أكريليت حول الغرسة ، لتغطية سطح الجمجمة المكشوف دون لمس الأنسجة العضلية المحيطة بالتراجع تغطية مساحة كبيرة من الجمجمة بهذا الغطاء الجمجمي ، سيساعد لاحقا في مرفق لوحة القاعدة.

بعد ذلك ، قم بخلط قاعدة نهاية المحفز من حقنة لاصقة من السيليكون وضع قطرة من المطاط الصناعي داخل سوار مسبار المنشور ، لتغطية الجزء العلوي من عدسة المسبار ، من أجل منع أي ضرر وغبار من الاستقرار. بعد أسبوع إلى 10 أيام من زرع مسبار المنشور ، تحقق من تعبير الفيروس في الأنسجة من خلال مسبار المنشور المزروع. لهذا ، قم بإزالة الغطاء اللاصق السيليكوني فوق سطح عدسة مسبار المنشور المزروعة.

افحص سطح عدسة المسبار ، ونظف أي حطام برفق ، باستخدام ورق العدسة والإيثانول بنسبة 70٪ ، للتأكد من نظافة سطح التصوير. بعد ذلك ، قم بتوصيل اللوح الأساسي بالمجهر وربط برغي ضبط اللوح الأساسي لتثبيته في موضعه. بعد ذلك ، قم بتأمين المجهر في قابض المجهر على ذراع المعالجة الدقيقة التجسيمية.

قم بتوصيل القابض بقضيب يمكن تركيبه على ذراع المعالجة الدقيقة التجسيمية. بعد ذلك ، ضع المجهر فوق عدسة مسبار المنشور ، باستخدام ذراع المعالجة الدقيقة التجسيمية. افحص الاتجاه بصريا من خلال عرض عدسة المنشور من جانب وخلف مرحلة.

محاذاة المحور البصري لكل من هدف المجهر ومسبار المنشور. بعد ذلك ، قم بتشغيل برنامج الاستحواذ ، وحدد المشروع ، وقم بتشغيل مؤشر LED المجهر من خلال البرنامج. قم بتقييم جودة محاذاة المجهر من خلال التركيز على المرحلة العليا من عدسة مسبار المنشور المزروعة في برنامج الاستحواذ ، عن طريق تحريك ذراع مناور التجسيم.

عند محاذاة المنظور بشكل صحيح ، يجب أن تظهر حواف عدسة مسبار المنشور حادة. اضبط المسافة المادية للمجهر فوق مسبار المنشور المزروع ، باستخدام ذراع مناور التجسيم للحصول على المستوى البؤري المطلوب داخل الأنسجة. بعد ذلك ، استخدم أكريليك الأسنان أو السيانو الأكريليك لربط لوحة القاعدة بشكل دائم بغطاء الأكريليك لسد الفجوة.

من الأهمية بمكان عدم وضع مادة لاصقة على أي جزء من جسم المجهر أو برغي التثبيت أثناء لصق لوحة القاعدة على رأس. الآن ، حرر المجهر من القابض واسحب القابض من المجهر. إذا تم استخدام السيانو أكريليك أو مادة لاصقة شفافة أخرى ، فقم بتغطيتها بطلاء أظافر أسود أو طبقة من الأسمنت الأسود للأسنان لمنع تسرب الضوء المحيط إلى غطاء الرأس ، مما قد يلوث الصور المستقبلية التي تم الحصول عليها أثناء التجارب.

بعد ذلك ، قم بحماية مسبار المنشور المزروع بغطاء لوحة القاعدة. في هذا الإجراء ، قم بتوصيل المجهر بصندوق الحصول على البيانات المتصل بالكمبيوتر وقم بتشغيل برنامج الاستحواذ. بعد ذلك ، قم بإزالة غطاء لوحة القاعدة ، عن طريق تدوير برغي مجموعة لوحة القاعدة عكس اتجاه عقارب الساعة ورفع غطاء لوحة القاعدة.

بذر المجهر في لوحة القاعدة على. يجب أن يستقر المجهر في مكانه بمساعدة المغناطيس الموجود على لوحة القاعدة. بعد ذلك ، قم بدفع برغي ضبط لوحة القاعدة حتى تشعر بمقاومة طفيفة.

بعد ذلك ، حدد إعدادات الاكتساب لاستخدامها لجمع البيانات ، والتي تتضمن معدل الإطارات لالتقاط البيانات. تحقق من الرسم البياني للصورة عند تحديد الإعدادات لضمان نسبة إشارة جيدة إلى الضوضاء. ثم ابدأ في الحصول على البيانات.

عند اكتمال التسجيل ، قم بفك برغي ضبط لوحة القاعدة وافصل المجهر عن لوحة القاعدة ، عن طريق سحب المجهر برفق. بعد ذلك ، استبدل غطاء لوحة القاعدة وشد برغي مجموعة لوحة القاعدة برفق. فيما يلي عرض توضيحي لحيوان مركب بالمجهر ، يتفاعل بحرية مع الأشياء الموجودة في ساحة السلوك.

أثناء التصوير المستيقظ مع النظام ، تم تسجيل نشاط الخلايا العصبية القشرية الحسية الجسدية عندما تعرض الفأر لثلاث بيئات مختلفة. حقل مفتوح في اليوم الأول ، والتعرف على الكائن في الأيام الثانية إلى الرابعة ، وللكائن الجديد في اليوم الخامس. بعد استخراج الخلايا باستخدام برنامج تحليل بيانات صورة الكالسيوم ، تم تراكب المرشحات المكانية المقابلة لمواقع الخلايا ، على متوسط إسقاط شدة التألق لبيانات تسجيل المجهر.

يفصل خط أبيض متقطع بين الطبقات الثانية والثالثة والخمس خلايا. تظهر آثار الكالسيوم المقابلة من خمس خلايا من كل طبقة نمط زراعة الخلايا في سياقين سلوكيين مختلفين: التعرف على الكائن والتعرض للكائن الجديد. كانت الطبقة الثانية وثلاث خلايا أكثر نشاطا مقارنة بخلايا الطبقة الخامسة في اليوم الذي تعرض فيه الفأر لجسم جديد.

فيما يلي بقية مؤامرات أنشطة الخلايا من لاعبي الكيان السطحي ، عندما كان في حقل مفتوح ، والتعرف على الأشياء واستكشاف الأشياء الجديدة. بمجرد إتقان كل تقنية ، يمكن إكمال كل تقنية في غضون ساعة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. بعد تطويرها ، تمهد هذه التقنية الطريق لباحثي علم الأعصاب في الأنظمة ، لاستكشاف أنواع معينة من الخلايا في مناطق مختلفة من الدماغ ، مع الاستفادة من نماذج السلوك المختلفة في droning ونماذج أخرى من الفيزيولوجيا العصبية في المرض.

من هذا البروتوكول ، يجب أن يكون لدى المرء فهم جيد لكيفية تسمية طبقات متعددة من القشرة الحسية الجسدية ، وزرع مسبار منشور وإرفاق مجهر مصغر مثبت على الرأس.