متعدد الطبقات الكالسيوم الكالسيوم

الهدف العام من هذا الإجراء هو السماح بالتصور المتزامن للنشاط العصبي عبر طبقات متعددة من العصبونات القشرية باستخدام مؤشرات الكالسيوم في فأر يتحرك بحرية، وفهم عمل الدوائر العصبية باستخدام مجهر فلوري مصغر مثبت على الرأس. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال علوم الأعصاب النظمية، مثل كيفية انتقال المعلومات عبر طبقات متعددة من القشرة المخية. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنها تسمح بتصور مجموعات كبيرة من العصبونات المشفرة جينيًا عبر طبقات قشرية متعددة في حيوانات تتحرك بحرية، وبشكل موثوق على مدار زمن طويل.

من أجل تصور العصبونات المشفرة جينياً من طبقات قشرية متعددة في حيوان يتحرك بحرية، يجب تنفيذ الإجراءات التالية، ويسلط هذا البروتوكول الضوء على زرع مسبار المنشور، وتركيب القاعدة، والتصوير الحي في فأر يتحرك بحرية. لبدء هذا الإجراء، وبعد مرور أسبوع إلى أسبوعين من حقن الفيروس، ضع الحيوان في جهاز التوجيه التجسيمي، واستعد لجراحة زرع مسبار المنشور عن طريق تعقيمه بـ 70% ethanol وتنظيفه بورق العدسات. بعد ذلك، قم بإجراء عملية ثقب دائرية للجمجمة باستخدام مثقاب دقيق بلقمة قطرها 0.5 millimeter.

تأكد من أن قطر ثقب الجمجمة أكبر قليلاً من قطر المنشور. ثم، حدد موضع ثقب الجمجمة بحيث يكون الحرف المسطح للمنشور مواجهاً لموقع حقن الفيروس وضمن نصف قطر يتراوح من 150 إلى 200 ميكرون عند إدراج المنشور في القشرة المخية. بعد ذلك، قم بإزالة الأم الجافية باستخدام ملقط دقيق.

حافظ دائماً على رطوبة الأنسجة باستخدام محلول ملحي معقم بمجرد كشف أنسجة الدماغ. سيعمل ذلك أيضاً على الحفاظ على الضغط على الأنسجة. ولتخفيف الضغط في أنسجة الدماغ أثناء إدخال المسبار المنشوري، قم بإنشاء مسار إدخال عن طريق تثبيت سكين تشريح مستقيمة الحافة في ذراع حامل القطب الكهربائي بجهاز التوجيه المجسم (stereotaxic apparatus).

قم بتثبيته بزاوية بحيث تكون صفيحة السكين عمودية على انحناء الجمجمة وفي مستوى موازٍ لعمود حقن الفيروس. ضع السكين بعناية فوق عملية فتح الجمجمة، على طول حافتها الإنسية الداخلية وعلى بُعد حوالي 200 microns جانبيًا من موقع حقن الفيروس مع توجيه حافة القطع نحو الخلف. قم بتصفير المحور Z عندما يلامس طرف السكين الأم الجافية.

بعد ذلك، قم بخفض السكين تدريجياً إلى العمق الذي سيتم إدخال مسبار المنشور فيه. ومن ثم، حرك السكين بمقدار 1 مليمتر للخلف لإنشاء مسار للحافة الأمامية للمنشور. اسحب السكين ببطء باستخدام المجهر الدقيق لذراع الجهاز التجسيمي (stereotaxic arm micromanipulator) بزيادات قدرها 10 micron في الثانية، وضع قطعة من إسفنج جيل فوم (gel foam sponge) مشبعة بمحلول ملحي معقم فوق الشق.

بعد ذلك، قم بتثبيت حامل العدسة بذراع الملاعب المجسمة (stereotaxic manipulator) بنفس الزاوية التي كانت عليها السكين في الخطوة السابقة. قم بمحاذاة المنشور بحيث يكون الجانب المسطح منه فوق الشق وموازياً لعمود حقن الفيروس. وبمجرد وصول المنشور إلى الزاوية الصحيحة، قم بخفضه تدريجياً داخل الدماغ بزيادات قدرها 10 micron حتى يصل إلى المستوى النهائي Z وهو 1.1 millimeter من سطح الدماغ، بالنسبة لهذا المسبار.

قم بتغطية أي أنسجة مكشوفة حول المنشور في فتحة القحف، بطبقة واقية رقيقة جداً من اللاصق المرن (elastomer adhesive)، باستخدام إبرة قياس 25. ولمنع تحرك العدسة داخل فتحة القحف، بعد تصلب اللاصق المرن، استخدم إبرة قياس 25 لوضع بعض من لاصق السيانوأكريليت (cyanoacrylate adhesive) لتثبيت زجاج عدسة المنشور بالجمجمة المجاورة فوق طبقة اللاصق المرن. وبمجرد تصلب لاصق السيانوأكريليت، قم بفك حامل العدسة وإزالة المجهر بعناية.

بعد ذلك، اسحب ذراع المانيبولاتور الخاصة بالجهاز التجسيمي ببطء، مع ترك مسبار المنشور مزروعًا بشكل آمن. ضع طبقة من أكريليك الأسنان أو لاصق السيانوأكريليت حول المزروعة، لتغطية سطح الجمجمة المكشوف دون لمس الأنسجة العضلية المتراجعة المحيطة. إن تغطية مساحة كبيرة من الجمجمة بهذه القبعة القحفية ستساعد لاحقًا في تثبيت الصفيحة القاعدية.

بعد ذلك، اخلط القاعدة والمحفز من سرنجة لاصق السيليكون وضع قطرة من الإلاستومر داخل غطاء مسبار المنشور، لتغطية الجزء العلوي من عدسة المسبار، وذلك لمنع حدوث أي تلف أو تراكم للغبار. بعد مرور أسبوع إلى 10 أيام من زرع مسبار المنشور، تحقق من التعبير الفيروسي في النسيج من خلال مسبار المنشور المزروع. وللقيام بذلك، قم بإزالة غطاء لاصق السيليكون الموجود فوق سطح عدسة مسبار المنشور المزروع.

افحص سطح عدسة المسبار، ونظف أي شوائب برفق باستخدام ورق تنظيف العدسات وإيثانول 70%، لضمان نظافة سطح التصوير. بعد ذلك، قم بتركيب صفيحة القاعدة في المجهر وأحكم ربط برغي تثبيت صفيحة القاعدة لتثبيتها في موضعها. ثم قم بتثبيت المجهر في ماسك المجهر الموجود على ذراع الميكرو-مناول التجسيمي.

قم بتثبيت القابض على قضيب يمكن تركيبه على ذراع الميكرو-مناور المجسم (stereotaxic micromanipulator). بعد ذلك، قم بوضع المجهر فوق عدسة مسبار المنشور باستخدام ذراع الميكرو-مناور المجسم. افحص التوجيه بصرياً عن طريق معاينة عدسة المنشور من الجانب ومن خلف منصة الحيوان.

يجب محاذاة المحور البصري لكل من عدسة microscope objective ومسبار prism probe. بعد ذلك، قم بتشغيل برنامج الاستحواذ، واختر المشروع، ثم قم بتشغيل LED الخاص بالمجهر من خلال البرنامج. قم بتقييم جودة محاذاة المجهر عن طريق التركيز على المرحلة العلوية لعدسة مسبار prism probe المزروع في برنامج الاستحواذ، وذلك عن طريق تحريك ذراع manipulator الخاص بجهاز stereotax.

عندما يتم المحاذاة بشكل صحيح، يجب أن تظهر حواف عدسة مسبار المنشور حادة. اضبط المسافة الفيزيائية للمجهر فوق مسبار المنشور المزروع، باستخدام ذراع التلاعب بالتوجيه المجسم (stereotaxic manipulator arm) للحصول على المستوى البؤري المطلوب داخل النسيج. بعد ذلك، استخدم أكريليك الأسنان أو سيانو أكريليك لتثبيت اللوحة الأساسية بشكل دائم في الغطاء الأكريلي لسد الفجوة.

من الضروري عدم وضع المادة اللاصقة على أي جزء من جسم المجهر أو مسمار التثبيت أثناء لصق اللوحة القاعدية برأس الحيوان. الآن، قم بتحرير المجهر من القابض وسحب القابض بعيداً عن المجهر. في حال استخدام سيانوأكريليت أو أي مادة لاصقة شفافة أخرى، قم بتغطيتها بطلاء أظافر أسود أو طبقة من إسمنت الأسنان الأسود لمنع تسرب الضوء المحيط إلى غطاء الرأس، الأمر الذي قد يؤدي إلى تلوث الصور التي سيتم الحصول عليها مستقبلاً خلال التجارب.

بعد ذلك، قم بحماية مسبار المنشور المزروع باستخدام غطاء لوحة القاعدة. في هذا الإجراء، قم بتوصيل المجهر بصندوق الحصول على البيانات المتصل بجهاز الكمبيوتر وقم بتشغيل برنامج الحصول على البيانات. ثم، قم بإزالة غطاء لوحة القاعدة عن طريق تدوير برغي تثبيت لوحة القاعدة عكس اتجاه عقارب الساعة ورفع غطاء لوحة القاعدة.

ثبّت المجهر في اللوحة الأساسية الموجودة على الحيوان. يجب أن يستقر المجهر في مكانه بمساعدة المغناطيسات الموجودة على اللوحة الأساسية. بعد ذلك، قم بتدوير برغي تثبيت اللوحة الأساسية حتى تشعر بمقاومة طفيفة.

بعد ذلك، اختر إعدادات الاستحواذ التي ستُستخدم لجمع البيانات، والتي تتضمن معدل الإطارات لالتقاط البيانات. تحقق من المدرج التكراري للصورة عند اختيار الإعدادات لضمان الحصول على نسبة إشارة إلى ضوضاء جيدة. ثم، ابدأ في استحواذ البيانات.

عند اكتمال التسجيل، قم بفك برغي تثبيت لوحة القاعدة وفصل المجهر عن لوحة القاعدة عن طريق سحب المجهر لأعلى برفق. بعد ذلك، أعد وضع غطاء لوحة القاعدة وأحكم ربط برغي تثبيت لوحة القاعدة برفق. إليكم عرض توضيحي لحيوان مثبت بالمجهر وهو يتفاعل بحرية مع الأشياء الموجودة في ساحة السلوك.

أثناء التصوير الحيوي للمس الفئران المستيقظة باستخدام النظام، تم تسجيل نشاط العصبونات في القشرة الحسية الجسدية عند تعريض الفأر لثلاث بيئات مختلفة: الحقل المفتوح في اليوم الأول، والتعرف على الأشياء من اليوم الثاني إلى الرابع، ثم تقديم جسم جديد في اليوم الخامس. وبعد استخراج الخلايا باستخدام برنامج تحليل بيانات صور الكالسيوم، تم وضع مرشحات مكانية مقابلة لمواقع الخلايا فوق مسقط متوسط كثافة الفلورة لبيانات تسجيل المجهر.

يفصل خط متقطع أبيض بين خلايا الطبقتين الثانية والثالثة والطبقة الخامسة. وتُظهر آثار الكالسيوم المقابلة لخمس خلايا من كل طبقة من الطبقات نمط إطلاق الخلايا في سياقين سلوكيين مختلفين: التعود على الجسم والتعرض لجسم جديد. وكانت خلايا الطبقتين الثانية والثالثة أكثر نشاطاً مقارنة بخلايا الطبقة الخامسة في اليوم الذي تعرض فيه الفأر لجسم جديد.

فيما يلي بقية المخططات الخاصة بأنشطة الخلايا من اللاعبين الكيانات السطحية، عندما كان الحيوان في المجال المفتوح، والألفة مع الأشياء، واستكشاف الأشياء الجديدة. وبمجرد إتقانها، يمكن إتمام كل تقنية في غضون ساعة واحدة إذا نُفذت بشكل صحيح. وبعد تطويرها، تمهد هذه التقنية الطريق لباحثي علوم الأعصاب النظمية لاستكشاف أنواع محددة من الخلايا في مناطق مختلفة من الدماغ، مع الاستفادة من نماذج سلوكية مختلفة في الطنين وغيرها من نماذج الفسيولوجيا العصبية في الأمراض.

من خلال هذا البروتوكول، ينبغي أن يكتسب الباحث فهماً جيداً لكيفية وسم طبقات متعددة من القشرة الحسية الجسدية، وزرع مسبار منشور، وتركيب مجهر مصغر مثبت على الرأس.