باستخدام تقنية PCR-نيون الشعرية جل الكهربائي إلى التركيب الوراثي كريسبر / Cas9 بوساطة خروج المغلوب المسوخ في تنسيق عالية الإنتاجية

الهدف العام من هذه التقنية هو تحديد الأنماط الجينية للمستنسخات الطافرة التي نتج عنها إدخال أو حذف بفعل CRISPR/Cas9 بطريقة عالية الإنتاجية. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال الوراثة، مثل التأثير المظهري لتعطيل جين معين في نموذج SAIL مختار. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في وجود مسح يتراوح من الحد الأدنى إلى الإنتاجية العالية وهو متعدد المرونة.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤى حول علم الوراثة للسرطان البشري، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً على أنظمة أخرى، مثل الخلايا البشرية، والخلايا الجذعية، والخلايا الأولية، أو الخلايا ذات الأصل غير البشري. لقد خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما أجرينا فحوصات تحديد النمط الجيني للتكرارات الترادفية القصيرة STR. لبدء الإجراء، يتم ترانسفكشن الخلايا المختارة ببلازميد يعبر بشكل مشترك عن Cas9 المسمى بملصق فلوري والحمض النووي الريبوزي الموجه المفرد sgRNA.

قم بمعالجة الخلايا بالتربسين واختر حوالي 3,500 مستنسخة مسمى فلوروسنتياً. وزع المستنسخات في مجموعات مكونة من 500 و1,000 و2,000 خلية في أطباق قطرها 10 centimeter في ثمانية ملليلتر من وسط نمو مضاف إليه البنسلين والستريبتومايسين. قم بحضن الخلايا في جو يحتوي على 5%co2 عند درجة حرارة 37 degrees celsius، مع استبدال الوسط كل خمسة أيام حتى تصبح مستعمرات الخلية الواحدة مرئية بالعين المجردة.

بعد ذلك، يتم سحب المستعمرات الفردية باستخدام ماصة سعة 200 ميكرولتر مع حوالي 5 ميكرولتر من وسط النمو. تُنقل كل مستعمرة إلى بئر منفصل يحتوي على 200 ميكرولتر من وسط النمو. يتم سحب المزيج في كل بئر وإطلاقه بالماصة بشكل متكرر لإعادة تعليق الخلايا.

قم بتحضين الخلايا تحت الظروف الموصوفة سابقاً حتى تصل الخلايا إلى درجة تلاقي تتراوح بين 50 إلى 90%. أزل وسط الزرع الزائد من الآبار، وأضف 25 µL من 0.05%trypsin EDTA الخالي من الفينول الأحمر إلى كل بئر. حضّن الخلايا عند 37 °C لمدة 7 دقائق.

بعد ذلك، قم بسحب الخلائط وإخراجها بالماصة بشكل متكرر لإعادة تعليق الخلايا المعالجة بالتريبسين. افحص الآبار تحت المجهر للتحقق من انفصال الخلايا عن جدران الآبار. ولتحضير مكررات من المستنسخات الفردية، انقل 5 µL من كل معلق خلوي إلى طبق زراعة فارغ مكون من 96 بئراً.

أضف 200 µL من وسط النمو إلى كل بئر. ثم املأ آبار صفيحة PCR فارغة مكونة من 96 بئراً بـ 10 µL من محلول التحلل (lysis buffer). انقل خمسة µL أخرى من كل معلق خلوي إلى صفيحة الـ 96 بئراً هذه.

قم بطرد مركزي سريع للطبق حتى يستقر السائل في قاع الآبار. أضف 200 µL من وسط النمو إلى الـ 15 µL المتبقية من كل معلق خلوي. قم بتخزين المعلق الأصلي والمكررات تحت ظروف الحضانة للتحقق لاحقاً من حالة التعطيل (knockout) للمستعمرات.

بعد ذلك، استخدم الدورة الحرارية لتحليل الخلايا تماماً في محلول التحلل. قم بطرد مركزي سريع للمواد المتحللة. خفف المواد المتحللة باستخدام 40 µL من الماء الخالي من النوكلييز.

قم برجّ المحلولات المجهزة (lysates) المخففة باستخدام جهاز الدوران المداري (Vortex) ثم قم بطردها مركزياً لفترة وجيزة. وقبل إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) الفلوري، قم بتصميم واختبار خصوصية عدة أزواج من البادئات غير الميمنة على خلايا النوع البري المجهزة. حدد زوج البادئات الأمثل، ثم احصل على البادئات الأمامية الميمنة بفلوروفور والبادئ العكسي غير الميمن.

تأكد من اختبار خصوصية البادئات باستخدام خلايا مُدوّمة، والتحلل باستخدام محلول التحلل المُحضّر محلياً، حيث قد تختلف النتائج عن تلك التي يتم الحصول عليها باستخدام DNA جينومي مُنقى. وباستخدام البادئات المحددة، قم بإجراء تفاعلات PCR فلورية بحجم 20 µL مع إضافة 3 µL من نواتج التحلل المُخففة لتضخيم المناطق المستهدفة. قم بتقييم حجم الكميات النسبية لنواتج تضخيم PCR عن طريق فصل 5 µL من هذه النواتج على هلام أغاروز بتركيز 1%.

لبدء تحضير العينات، استخدم الماء الخالي من النوكلياز لتخفيف نواتج تضخيم الحمض النووي من النوع البري والحمض النووي المستهدف بواسطة CRISPR/Cas9 إلى تركيز تقريبي يبلغ 2.5 nanograms per microliter. اخلط أحجاماً متساوية من عينات الحمض النووي المخففة من النوع البري والمستهدفة. قم بتعبئة آبار لوحة PCR ذات 96 بئراً بتسعة ميكرولتر من خليط بنسبة 29 إلى 1 من الفورماميد منزوع الأيونات ومعيار حجم مُوسوم بصبغة، وميكرولتر واحد من نواتج التضخيم المختلطة.

أغلق الطبق بإحكام وسخن العينات عند 95 degrees celsius لمدة ثلاث دقائق باستخدام جهاز PCR thermocycler. بعد التسخين مباشرة، برد الطبق على الثلج لمدة ثلاث دقائق. ثم أجرِ عملية capillary gel electrophoresis باستخدام genetic analyzer.

بعد اكتمال عملية الرحلان الكهربائي، قم باستيراد البيانات إلى برنامج التحليل ورسمها بيانياً. تحقق من جودة معيار الحجم من خلال مراجعة البيانات في قناة الصبغة المناسبة. بعد ذلك، قم بتصدير قيم قناة الصبغة لعناصر التحكم من النوع البري غير المستهدفة والمستنسخات المستهدفة بتنسيق txt.

من هذا الملف، استورد هويات الصبغة، وأسماء ملفات العينات، وأحجام القطع، وقيم ارتفاع القمة إلى برنامج جداول البيانات. احسب الفرق في حجم القطعة بين المستنسخ المستهدف والنوع البري غير المستهدف في كل عينة. حدد المستنسخات التي تحتوي على طفرات إدخال أو حذف (indel) ليست من مضاعفات ثلاثة أزواج قاعدية.

قم بتوسيع المستعمرات المختارة تسلسلياً من المكررات المخزنة. أجرِ تسلسل سانجر وتحليل "وسترن بلوت" لتحديد الأنماط الجينية للمستعمرات والتحقق من حالة التعطيل الجيني (knockout) للمستعمرات. تم استهداف خط خلايا سرطان الخلايا الكبدية HEPG2 باستخدام بناء CRISPR/Cas9 ضد جين Nap1L1.

تم تضخيم الأليلات البرية غير المستهدفة والأليلات المستهدفة بواسطة CRISPR/Cas9 باستخدام بادئات معلمة بفلوروفورات خضراء وزرقاء، على التوالي. ومن خلال استخدام بروتوكول PCR فلوري مُحسَّن خصيصاً، تم الحصول على نواتج تضخيم المستنسخات المستهدفة بمردود جيد. ولم يُلاحظ أي تداخل بين الأصباغ الفلورية الخضراء والزرقاء داخل عينات المستنسخات الفردية.

كشف تحليل أحجام القطع، التي تم تحديدها بواسطة الفصل الكهربائي للهلام الشعري، عن حذف زوج قاعدي واحد و10 أزواج قاعدية من المستنسخين الموضحين هنا. وكانت نتائج تسلسل سانجر متوافقة مع تحليل الفصل الكهربائي للهلام الشعري. كما أكد تحليل ويسترن للدم أن المستنسخات المختارة لم تعبر عن NAP1L1.

عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر وضع ملصقات تعريفية على العينات بدقة، نظراً لوجود العديد من العينات المشاركة، وكذلك تقليل وقت تعريض نواتج تضخيم الـ amplicon الموسومة بالفلوروفور لأنها حساسة للضوء. وبعد هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل الـ quantitative RT PCR، وتحليل الـ western blot، وتسلسل سانجر (Sanger sequencing) للإجابة على أسئلة إضافية مثل تحديد الجينات المستهدفة، وما إذا كان قد تم تعطيلها بالكامل. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحديد النمط الجيني لمستنسخات الطفرات المستحدثة بواسطة CRISPR/Cas9 بطريقة عالية الإنتاجية باستخدام PCR الفلوري المقترن بالترحيل الكهربائي للهلام الشعري.