Name: وهناك طريقة للحصول على إنتاج بروتين المؤتلف mCD1d في خلايا الحشرات. (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-12-10T22:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: تعلم إنتاج بروتين mCD1d المؤتلف في خلايا الحشرات High Five باستخدام عدوى baculovirus. تُستخدم هذه الطريقة لإنشاء رباعيات CD1d لدراسة خلايا NKT في البحوث المناعية التنموية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

أولا ذوبان للخلايا يأخذ قنينة TN5 المجمدة للخلايا ، وذوبان الجليد في حمام ماء C ° 37. إضافة 5ml المتوسطة عبر عن الحشرات (Invitrogen ، وأنواع ، عدد 10486) في دورق 25cm TC 2. علما بأن اكسبريس five يأتي دون الجلوتامين ، تحتاج إلى إضافة 10ML من بكتيريا القلم الجلوتامين 100X أو الجلوتامين وحدها إلى وسائل الإعلام ليتر 1. إضافة الى ذلك TN5 الخلايا واحتضان لمدة 30 دقيقة في الحاضنة 27 درجة مئوية. ثم نضح المتوسط ​​مع DMSO بلطف من دون إزعاج الخلايا التي تعلق على الجزء السفلي من القارورة. إضافة 5ml المتوسطة الطازجة. II. المتنامية والتوسع في خلايا رصد خلايا في كل يوم. عندما القارورة ما يقرب من 70 ٪ متموجة ، وجعل الخلايا في التعليق من ضجيجا القارورة على كلا الجانبين ، ونقل الخلايا إلى 175cm 2 قارورة بإضافة 21 مل من التعبير عن الحشرات والمتوسطة 5ml للثقافة الخلية. وينبغي أن يكون كل قارورة T175 حوالي 25 - 30ml المتوسط ​​كوحدة تخزين النهائي. انقسام قارورة متموجة (حوالي 1 مليون / مل اضرب.) 1 / 4 أو 1 / 5 حسب الحاجة. لا تدع الخلايا كسا الأرض. عد عدد من المقاطع التي لديك انقسام الخلايا. لا تنمو أكثر من عدد مرور 30 ​​لأنه قد يسبب شيخوخة الخلايا الناتجة تحلل الخلية. عندما تصل إلى حجم المطلوب في تركيز 1 مل / مليون تصيب الخلايا. أنا تنمو عادة ما يصل إلى 2 إلى 2.5 ليتر ، والذي يصل عادة إلى قوارير 175cm 2 وسبعين تقريبا. 25 إلى قارورة 30ml / أو خمسة مخروطي 1 لتر وقوارير تقريبا. 400ml الى 500 مل في كل قارورة ملاحظة : إما يمكن أن تنمو في خلايا T - 175 سد القارورة الختم أو كورنينج دورق مخروطي. الخلايا المتنامية في قوارير مخروطي هو أسرع وأسهل. III. Titering الفيروس عن طريق نقطة النهاية أسلوب التخفيف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة 3000-5000 الخلايا بشكل جيد في شقة في لوحة أسفل بشكل جيد في 96 200ul المتوسطة اكسبريس SFM الخمسة. السماح للخلايا تستقر عند 27 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل المسلسل التخفيف من الأسهم الفيروسة العصوية. ينبغي للمرء أن يفعل 10/01 التخفيف في سطر واحد من 96 لوحة أسفل U جيدا ، وذلك باستخدام 250ul لكل بئر. يتم إجراء التخفيفات في المتوسط ​​خمسة اكسبريس SFM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ماصة الأقنية ، ونقل مبلغ ثابت (عادة 20 ماي) من التخفيفات المختلفة للخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة حتى 27 درجة مئوية لمدة 7 أيام. لتجنب التبخر من حافة الصفوف ، والتفاف حواف الصفيحة مع parafilm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 7 أيام ، والتحقق من لوحة وتحديد التخفيف من فيروس العدوى يعطي 50 ٪ -- نصف عدد المصابين بهذا المرض في هذه الآبار تركيز الفيروس). ثم استخدام صيغة لحساب عيار ، وهو ما يعبر عنه في pfu / مل (pfu - البلاك تشكيل وحدات). تم العثور على أدلة في الصيغة الأكثر الفيروسة العصوية. </li></ol> رابعا. اصابة الخلايا من المهم جدا أن نعرف بالضبط من عيار الفيروس. إضافة المبلغ المطلوب من الفيروس. وينبغي لإعداد المخزون الفيروسية تصاب الخلايا في تعدد العدوى (وزارة الداخلية) لا تزيد عن 1 (1pfu 1High إلى خمسة الخلية) العالي وزارة الداخلية يؤدي إلى إنتاج الطفرات الفيروسية. لإنتاج البروتين ، والمبلغ المعتاد هو MO1 50-10. على سبيل المثال : وعيار من الفيروسة العصوية mCD1d = 1X108 pfu / مل وزارة الداخلية إضافة = 1 (لتضخيم الفيروس) = 20X10 ^ 6 خلية / قارورة / 1X10 ^ 8 pfu / مل UL = 200 / القارورة وزارة الداخلية = 5 إلى 10 (لإنتاج بروتين) = 1ml 2ml بالنسبة إلى 20x10 ^ 6 خلية / القارورة في يوم 4 بعد العدوى ، وننظر إلى الخلايا المصابة. يجب فصل فيه ، العائمة ، والنقانق وتشكيل تورم. خامسا استعادة Supernatants تتخذ وسيلة من قوارير المصابة ، ونقل إلى اللون الأزرق زجاجات 250ml فالكون غطاء للغزل. ويمكن تعقيمها أنهم وإعادة استخدامها. تعبئة الزجاجات بالتساوي والخلايا في جهاز الطرد المركزي Sorvall GSA الدوار في 200rpm ، 20 دقيقة ، 4 درجات مئوية. جمع طاف والمضي قدما نحو المزيد من التنقية. سادسا. تنقية المؤتلف mCD1d <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسيل الكلى وتركيز الصوديوم في 150mM العازلة الفوسفات (درجة الحموضة 7.4) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بواسطة الكروماتوجراف Agarose ني NTA ، أزل البروتين mCD1d + b2m مع 150mM الصوديوم Immidazole الفوسفات ملي +200 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل عمود التحلية باستخدام 20mM تريس هيدروكلورايد pH8 العازلة للتخلص من Immidazole </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل Exchange باستخدام الكروماتوغرافيا الأنيون MonoQ العمود للقضاء على الملوثات المتبقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التركيز على استخدام 1mg/ml YM 30 المكثف (ميليبور) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> mCD1d البيرا biotynlation الأنزيمية وفقا لبروتوكول من الشركة المصنعة (الطمع) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم التخلص من البيوتين S200 مجانا من العمود (حجم Chromatograpy الاستبعاد) باستخدام الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) ، pH7.4. ويمكن الحصول على المتوسط ​​من 2 إلى 3 ملغ من البروتين biotynlated من 2 لتر من طاف </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنتاج - Galcer CD1d tetramer. </li></ol> من أجل تحميل جزيء CD1d مع Galcer ، ذوبان biotynlated CD1d - B2وبين عشية وضحاها م المحتضنة في درجة حرارة الغرفة مع فائض three المولي أضعاف من Galcer ، الذائبة في توين -20 بنسبة 0.5 ٪ في برنامج تلفزيوني ، O.9 ٪ كلوريد الصوديوم. Tetramers تتولد عن طريق خلط ل- Galcer تحميل مونومرات CD1d مع فائض 4 أضعاف من المولي PE -- streptavidin مترافق واحتضان لمدة 4 ساعات في درجة حرارة الغرفة. متجر في 48 درجة مئوية.

<ol><li>Benlagha, K., Weiss, A., Beavis, A., Teyton, L., Bendelac, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+identification+of+glycolipipd+antigen-specific+T+cells+using+fluorecent+CD1d+tetramers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo identification of glycolipipd antigen-specific T cells using fluorecent CD1d tetramers.</a> J. Exp. Med. 191, 1895-1903 (2000).</li>
<li>Kinjo, Y., Wu, D., Kim, G., Xing, G. W., Poles, M. A., Ho, D. D., Tsuji, M., Kawahara, K., Wong, C. H., Kronenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+bacterial+glycosphingolipids+by+natural+killer+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Recognition of bacterial glycosphingolipids by natural killer T cells.</a> Nature. 434, 520-525 (2005).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+and+antigen+presentation+of+ceramide-containing+glycolipids+by+soluble+mouse+and+human+CD1d+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Binding and antigen presentation of ceramide-containing glycolipids by soluble mouse and human CD1d molecules.</a> J. Exp. Med. 190, 1069-1080 (1999).</li>
<li>Porcelli, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CD1+family%3A+A+third+lineage+of+antigen-+presenting+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The CD1 family: A third lineage of antigen- presenting molecules.</a> Adv. Immunol. 59, 1-98 (1995).</li>
<li>Sidobre, S., Kronemberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD1+tetramers%3A+A+powerful+tool+for+the+analysis+of+glycolipid-reactive+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD1 tetramers: A powerful tool for the analysis of glycolipid-reactive T cells.</a> J. Immunol. 169, 1340-1348 (2002).</li>
</ol>

في هذا الإجراء ، فإنه يظهر كيفية بدء وينمون وتصيب خلايا الحشرات وكيفية عيار الفيروسة العصوية في استخدام هذه الخلايا. وأهم جوانب هذا الإجراء وصيانة الخلايا ومعرفة عيار الدقيق للالفيروسة العصوية. ذات مرة كنت قد ولدت CD1 tetramers ، يمكن استخدامها كأداة قوية لتحليل الخلايا التائية شحمي سكري على رد الفعل. كما تستخدم على نطاق واسع لأنظمة الفيروسة العصوية انتاج البروتينات المؤتلف ، بما في ذلك tetramers MHC الدرجة الثانية ولذلك فإن هذا الإجراء لديه تطبيقها على نطاق أوسع من ذلك بكثير.

<table><tbody><tr><td>Express Five SFM</td><td>وسط خالٍ من المصل</td><td>Invitrogen</td><td>10486025</td><td></td></tr><tr><td>High Five TM</td><td>خلايا حشرية</td><td>Invitrogen</td><td>B855-02</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine Pen strep</td><td>مضادات حيوية</td><td>Invitrogen</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>25cm2 TC Flask</td><td>بلاستيك</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-126-28</td><td></td></tr><tr><td>175 cm2 TC Flask</td><td>دورق بسدادة</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-126-8</td><td></td></tr><tr><td>Erlenmeyer Flask</td><td>دورق زراعة الخلايا</td><td>Fisher Scientific</td><td>07 200 672</td><td></td></tr><tr><td>YM 30 Concenterator</td><td>30,000 MWCO</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC 903096</td><td></td></tr><tr><td>FPLC equipment</td><td></td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BrA Enzyme and Buffer</td><td>طقم البيوتينيلة</td><td>Avidity</td><td>BIRA500</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA Agarose Column</td><td>عمود تنقية البروتين بـ His Tag</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Desalting column</td><td>لإزالة الأملاح من البروتين</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MonoQ Column</td><td>كروماتوغرافيا التبادل الأنيوني</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>S200 Column</td><td>كروماتوغرافيا استبعاد الحجم</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>alpha-Galcer</td><td>جليكوليبيد</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PE- Streptavidin</td><td>لربط البروتين</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>S-866</td><td></td></tr></tbody></table>

وهناك طريقة للحصول على إنتاج بروتين المؤتلف mcd1d في خلايا الحشرات.

A Method For Production of Recombinant mCD1d Protein in Insect Cells.

CD1 البروتينات تشكل الطبقة الثالثة من مستضد تقديم الجزيئات. هم جليكوبروتينات سطح الخلية ، كما عبر عنها سلاسل الثقيلة حوالي 50 كيلو دالتون الغليكوزيلاتي التي ترتبط مع noncovalently المكروغلوبولين beta2 -. انهم ربط الدهون بدلا من الببتيدات. على الرغم من بنيتها يؤكد تشابه البروتينات CD1 MHC إلى الصف الأول والجزيئات الدرجة الثانية تقديم المستضد ، الأخدود mCD1d ضيقة نسبيا ، وعميقة ، ومسعور جدا وفقد اثنين من جيوب ملزم بدلا من جيوب الضحلة الموصوفة لعدة الكلاسيكية MHC - ترميز مستضد تقديم الجزيئات. بناء على تسلسل هذه الأحماض الأمينية ، وهذا الأخدود hydrobphobic يوفر بيئة مثالية لربط مستضدات الدهون. من الطبيعي القاتل T (NKT) استخدام الخلايا TCR على الاعتراف glycolipids ملزمة أو قدمها CD1d. وقد شاركت الخلايا التائية المتفاعلة إلى الدهون التي قدمها CD1 في الحماية ضد الأمراض المعدية والمناعة الذاتية ورفض في الورم. وبالتالي ، فإن القدرة على تحديد وتطهير ، وتتبع استجابة الخلية NKT CD1 التفاعل ذو أهمية كبيرة. جيل tetramers ألفا Galactosyl سيراميد (A - Galcer) مع CD1d وبصيرة هامة في بيولوجيا الخلايا NKT. Tetramers مصنوعة من جزيئات CD1 الأخرى كما تم إنشاؤها وهذه الكواشف الجديدة قد وسعت كثيرا من المعارف وظائف الخلايا التائية الدهون التفاعل ، مع إمكانية استخدامها في رصد استجابة لدهن المستندة إلى اللقاحات وفي تشخيص أمراض المناعة الذاتية وغيرها العلاجات.

طريقة لتحضير خلايا الحشرات والعدوى لهم الفيروسة العصوية للغرض من إنتاج المؤتلف proteinand mCD1d توليد tetramers mCD1d.

وهناك طريقة للحصول على إنتاج بروتين المؤتلف mCD1d في خلايا الحشرات.

تشكل بروتينات CD1 فئة ثالثة من جزيئات تقديم المستضد. وهي عبارة عن بروتينات سكرية على سطح الخلية، يتم التعبير عنها في شكل بروتينات سكرية تبلغ كتلتها الجزيئية حوالي 50 كيلو دالتون...

مرحباً، أنا أشرا كورونا من مختبر الدكتور ميتش كرونينبرج في قسم المناعة التنموية بمعهد لا جولا للحساسية والمناعة. سأوضح لكم اليوم كيفية تحضير خلايا الحشرات high five وإصابتها بـ VIR بغرض إنتاج MA CD 1D tetramers. تُستخدم CD 1D tetramers في مختبرنا وفي مختبرات أخرى للتعرف على خلايا NKT.تُستخدم أنظمة VIR على نطاق واسع لإنتاج البروتينات المعاد تركيبها، بما في ذلك الارتعاشات من الفئة الثانية MS C TE. لذا، فإن الإجراء الذي سيُعرض عليك يتمتع بتطبيقات أوسع بكثير. يتضمن هذا الإجراء تحفيز وتنمية خلايا الحشرات high five، ثم إصابة الخلايا بفيروس reovirus الذي يحمل CD 1D CDNA، وحصاد السائل الطافي عن طريق الطرد المركزي بعد أربعة أيام من الإصابة، ثم إجراء التحلل عند تركيز البروتين في محلول منظم من فوسفات الصوديوم بتركيز 150 millimeter، وpH 7.4، وتنقية بروتين mouse CD 1D بواسطة nickel and T agros وطريقة iron exchange romme، وتركيز M CD one G protein إلى one me per ML باستخدام مركز YM 30، حيث يتم إجراء التحقق الإنزيمي من mouse CD 1D بواسطة بروتوكول AVID D، وإزالة BioTeam الحر باستخدام عمود S 200.وأخيراً، إنتاج alpha gel CD 1D Tet. ورغم أن الإجراء بأكمله يتضمن كل هذه الخطوات، إلا أننا سنوضح لكم اليوم فقط كيفية التعامل مع هذه الخلايا وإصابتها بالفيروسات لغرض توليد المزيد من CD 1D tremors. فلنبدأ.بدايةً، أود أن أوضح لكم كيفية التعامل مع خلايا الحشرات من سلالة TN five؛ حيث تعود أصول سلالة خلايا high five إلى الخلايا المبيضية لحشرة دودة الكرنب. وتُستخدم هذه الخلايا في هذا البروتوكول لأنها تنمو في وسط خالٍ من المصل، وقابلة للتكيف مع الزراعة المعلقة، وتنتج مستويات عالية من البروتين المؤتلف في 5 ml من وسط insect express medium داخل دوارق زراعة أنسجة بمساحة 25 centimeter square. يرجى ملاحظة أن وسط express five يأتي بدون glutamine.لذا، نحتاج إلى إضافة 10 ml من glutamine pen strip بتركيز 100x، أو glutamine بمفرده، إلى لتر واحد من الوسط الغذائي. الآن، سأقوم بأخذ الأنبولة المجمدة من خلايا الحشرات high five، وإذابتها في حمام مائي عند درجة حرارة 37 °C، ثم إضافة خلايا الحشرات high five فوراً إلى الدورق وتحضينها لمدة 30 دقيقة في حاضنة عند درجة حرارة 27 °C. بعد ذلك، يتم سحب الوسط الغذائي للتخلص من الوسط الذي يحتوي على DMSO بلطف، دون تعريض الخلايا الملتصقة بقاع الدورق للاضطراب.نحتاج الآن إلى إضافة 5 ml من الوسط الغذائي الطازج إلى القارورة بعد عملية التذويب، حيث يتعين علينا الآن زيادة عدد الخلايا قبل إصابتها بالفيروس. يتم مراقبة الخلايا يومياً، وعندما تصل درجة الامتلاء في القارورة إلى 70% تقريباً، يتم تعليق الخلايا عن طريق النقر على جانبي القارورة.انقل الخلايا إلى دورق مربع سعة 75 سنتيمتر مربع عن طريق إضافة 25 ml من وسط Insect Express و 5 ml من مستنبت الخلايا من دورق تقسيم الخلايا. تكون نسبة التقسيم من 1 إلى 4 أو 1 إلى 5 حسب الحاجة. لا تسمح بنمو الخلايا بشكل مفرط، وقم بحساب عدد الممرات التي قمت فيها بتقسيم الخلايا.يجب عدم تجاوز الممر رقم 30 لأن ذلك قد يؤدي إلى شيخوخة الخلايا مما ينتج عنه تحلل خلوي. يجب تقسيم الخلايا يوماً بعد يوم. وفي حال التقسيم، تكون النسبة من واحد إلى خمسة.عند الوصول إلى الحجم المطلوب بتركيز مليون خلية لكل ML، قم بإصابة الخلايا؛ وعادةً ما أقوم بتربية الخلايا حتى حجم لترين، وهو ما يعادل عادةً 71 قارورة مقاس 75 سنتيمتر وبحوالي 25 ml لكل قارورة، أو أربع قوارير ER سعة لتر واحد وبحوالي 500 ml لكل قارورة. إن تربية الخلايا في قوارير ER تكون أسرع بكثير؛ حيث يتم وضع 100 ml من المزرعة و 400 ml من وسط express five SFM، وتنميتها في جهاز هزاز بسرعة 125 RPM وعند درجة حرارة 27 درجة Celsius حتى نصل إلى مليون خلية لكل ML من الحجم المطلوب قبل إصابة الخلايا. أود أن أوضح لكم كيفية معايرة الفيروس، وسنقوم بذلك في الخطوة التالية. ومن أجل معايرة الفيروس، يتم وضع 3000 إلى 5,000 خلية في كل بئر.قم بتوزيع الخلايا في طبق 96 بئر ذو قاع مسطح في 200 µL من وسط insect express five SFM. اترك الخلايا تترسب عند 27 °C لمدة 30 دقيقة على الأقل. قم بإجراء التخفيف التسلسلي لمخزون avius.يجب إجراء تخفيف تسلسلي في صف واحد من طبق 96 بئراً، باستخدام 250 µL لكل بئر. يتم إجراء التخفيفات في وسط express five SFM.باستخدام ماصة متعددة القنوات، انقل كمية ثابتة، عادةً 20 µL من التخفيفات المختلفة إلى المزارع الخلوية في حاضنة عند درجة حرارة 27 °C لمدة سبعة أيام لتجنب التبخر من الصفوف الطرفية. قم بلف حواف الطبق بورق الألمنيوم بعد مرور سبعة أيام. افحص الطبق وحدد أي تخفيف من الفيروس يعطي نسبة عدوى 50%.بعد ذلك، استخدم صيغة لحساب العيار، والذي يُعبر عنه بوحدة PFU لكل ml. تتوفر هذه الصيغة في معظم أدلة الفيروسات. بعد تحديد عيار الفيروس، يجب أن تكون تعددية العدوى، وهي الكمية المطلوبة من الفيروس لإصابة الخلايا من أجل إنتاج البروتين، ما بين 5 إلى 10.على سبيل المثال، إذا كان عيار فيروس belo في فئران CD 1D أقل من مئة مليون وحدة تشكيل لويحة لكل ml وكان لدينا 20 مليون خلية لكل دورق، فإننا نحتاج إلى إضافة 1 ml إلى 2 ml من فيروس belo لإصابة الخلايا. يجب ترك الخلايا مصابة لمدة أربعة أيام. وفي اليوم الرابع بعد الإصابة، يجب أن تكون الخلايا قد انفصلت، وطافية، ومنتفخة، ومُشكلةً أشكالاً تشبه السجق.حان الوقت الآن لاستعادة الطافي. خذ الوسط من القارورة المصابة وانقله إلى زجاجات فالكون ذات الغطاء الأزرق وسعة 250 ml. يمكن تعقيم هذه الزجاجات بجهاز الموصدة (autoclave) وإعادة استخدامها.املأ الزجاجات بالتساوي وأرسلها إلى جهاز الطرد المركزي لفصل الخلايا باستخدام دوار GSA بسرعة 2000 RPM، لمدة 20 دقيقة عند درجة حرارة 4 °C. اجمع السائل الطافي وتابِع في عمليات التنقية الإضافية. لقد أوضحت لكم للتو كيفية تحضير وتنمية وإصابة خلايا الحشرات high five وتقدير عيار فيروس balo.عند استخدام هذه الخلايا، تتمثل أهم جوانب هذا الإجراء في كيفية الحفاظ على الخلايا وكيفية معرفة العيار الدقيق لفيروس baus. وبمجرد توليد CD 1D tremors، يمكن استخدامها كأداة قوية لتحليل الخلايا التائية التفاعلية مع الجليكوليبيد. كما يمكن تطبيق هذا الإجراء الخاص بالتعامل مع فيروس balo وتعييره على العديد من البروتينات المؤشبة الأخرى أيضاً.هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة وبالتوفيق في تجاربكم.

a-method-for-production-of-recombinant-mcd1d-protein-in-insect-cells

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

في عصر ما بعد الجينوم البشري، وتوافر البروتينات المؤتلف في التشكل الأصلية أمر حاسم لبحث الهيكلية والوظيفية والعلاجية والتنمية. هنا، نحن تصف تجارب واسعة النطاق نظام التعبير بروتين في الخلايا الجنينية البشرية 293T الكلى التي يمكن استخدامها لإنتاج مجموعة متنوعة من البروتينات المؤتلف.

ومنهاج عمل مريحة والتعبير العام لانتاج البروتينات يفرز من خلايا الإنسان

مجمعات البروتين تحفيز الوظائف الخلوية الرئيسية. مفصلة توصيف وظيفي وهيكلي للعديد من المجمعات الأساسية يتطلب إنتاج المؤتلف. MultiBac هو نظام خلية الفيروسة العصوية / الحشرات مصممة بشكل خاص للتعبير عن البروتينات حقيقية النواة والمجمعات الخاصة بهم. تم تنفيذ MultiBac بمثابة منصة مفتوحة الوصول، وإجراءات التشغيل القياسية وضعت لتعظيم فائدتها.

على البروتين MultiBac مجمع منصة الإنتاج في EMBL

هنا، ونحن نستخدم تنبيغ فيروسات وترنسفكأيشن concatemeric لإنشاء خط الخلية التي يمكن أن تعبر عن مكونات ناقلات lentiviral (LV) في غياب التتراسيكلين. هذا LV بترميز GFP وpseudotyped مع بروتين سكري، SVGmu، والتي هي محددة لمستقبلات على الخلايا الجذعية.

خط خلية التتراسيكلين التنظيم وتنتج ناقلات lentiviral عالي عيار التي تستهدف على وجه التحديد خلايا الجذعية

Kindlins أساسية لالتصاق الخلية من خلال لل integrins ولكن تعرقلت الدراسات منهم من الصعوبة التي واجهتها في التعبير عنها في recombinantly المضيفين البكتيرية. نحن هنا وصف الطرق لكفاءة الإنتاج في خلايا الحشرات المصابة الفيروسة العصوية.

كفاءة الإنتاج وتنقية المؤتلف الفئران Kindlin-3 من خلايا الحشرات للدراسات البيوفيزيائية

في هذه الدراسة ، تمت مقارنة التعبير عن بروتين مؤتلف بشري مستهدف في منصات إنتاج مختلفة. ركزنا على الثقافات التقليدية القائمة على التخمير وعلى النباتات ، ووصفنا إعداد كل نظام وسلطنا الضوء ، على أساس النتائج المبلغ عنها ، على الحدود والمزايا المتأصلة لكل منصة.

تحليل مقارن التعبير المؤتلف البروتين في Biofactories مختلفة: البكتيريا، خلايا الحشرات ونظم النبات

والمستغلة نظم التعبير خلية الحشرات Nonlytic لإنتاج الخلوية الاتجار / الترجمة، والتحليل الوظيفي البروتين المؤتلف. هنا، نحن تصف وسائل لتوليد ناقلات التعبير ولاحق بروتين تعبير عابر في خطوط الخلايا حرشفية الأجنحة المتاحة تجاريا. سيعرض أيضا شارك في توطين aquaporins الذبابة البيضاء Bemisia مع البروتينات علامة فلوري التحت خلوية.

التعبير عابرة والخلوية توطين البروتينات المؤتلف في الخلايا مثقف الحشرات

نحن تقرير استخدام اصطناعية إينترونيك صغيرة رنا تعبير استراتيجية لتطوير غير تالف المؤتلف دينسوفيروس (آيدف) بعوض الزاعجة المصرية في فيفو نظام التسليم. ويرد وصف إجراء مفصل للبناء والتعبئة والتغليف، والتحليل الكمي لناقلات رايدف، وكذلك فيما يتعلق بالإصابة باليرقات.

استخدام دينسوفيروس المؤتلف البعوض ناقل توصيل جينات للتحليل الوظيفي للجينات في يرقات البعوض

ويصف هذا البروتوكول نظام تعبير بروتين الصدمة الناجمة عن حرارة (بدهسب/V5-صاحب/sf9 خلية النظام)، التي يمكن استخدامها للتعبير عن البروتينات الخارجية أو تقييم apoptotic مكافحة نشاط البروتينات الخارجية المحتملة وما مبتوراً الأمينية الأحماض في خلايا الحشرات.

تعبير عابر "للجينات الأجنبية" في "خلايا الحشرات" (sf9) "البروتين المقايسة الوظيفية"

هنا، نحن نقدم بروتوكولا لإنتاج البيت كاربوكسيليستيراسي يطير البروتينات في المختبر مع نظام تعبير خلية الحشرات باكولوفيروس بوساطة ولاحقا وظيفيا تميز أدوارها في التاييض بيرميثرين، وبالتالي، تمنح للبيرويثرويد المقاومة بدراسات تستند إلى خلية MTT المقايسة و في المختبر الأيضية.

توصيف وظيفي من كاربوكسيليستيراسيس في البيت مقاومة المبيدات الحشرية الذباب و الذبابة مستأنسة

نقدم هنا، البروتوكولات من أجل الاستفادة من الحشرات خلية باكولوفيروس البروتين التعبير النظام وإنتاج كميات كبيرة من البروتينات النباتية يفرز لبلورة البروتينات. لقد تم تعديل ناقل تعبير باكولوفيروس مع GP67 أو الببتيد إشارة هيمولين الحشرات للنبات التعبير إفراز البروتين في خلايا الحشرات.

تعديل ناقلات التعبير باكولوفيروس لإنتاج يفرز البروتينات النباتية في خلايا الحشرات

نظام ناقلات التعبير عن الفيروسات الكولوئية (BEVS) هو منصة قوية لفحص التعبير وإنتاج البروتين أرجينين ميثيل ترانسفيراس (PRMTs) لاستخدامها في الدراسات الكيميائية الحيوية والفيزيائية الحيوية والهيكلية. يمكن إنتاج كميات ملليغرام من المواد لغالبية PRMTs والبروتينات الأخرى ذات الأهمية التي تتطلب منصة التعبير eukaryotic.

إنتاج بروتينات PRMT المؤتلفة باستخدام نظام ناقلات التعبير عن فيروس باكولو

تعلم إنتاج بروتين mCD1d المؤتلف في خلايا الحشرات High Five باستخدام عدوى baculovirus. تُستخدم هذه الطريقة لإنشاء رباعيات CD1d لدراسة خلايا NKT في البحوث المناعية التنموية.

وهناك طريقة للحصول على إنتاج بروتين المؤتلف mCD1d في خلايا الحشرات.

استكشف المزيد من الفيديوهات