طريقة الكهربية لالكامل خلية الجهد المشبك تسجيلات من

الهدف العام من هذا الإجراء هو الحصول على تسجيلات تثبيت الجهد للخلية كاملة من خلية مستقبلة ضوئية واحدة لقياس التيارات المستحثة بالضوء والناشئة عن امتصاص فوتون واحد والاستجابات المتكررة للضوء الشديد. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في معالجة موضوعات رئيسية في مجال التنبيغ الحسي، مثل التنبيغ البصري لكل من الآليات الفيزيائية والأيونية التي تقوم عليها عملية التنبيغ الضوئي وخصائص قنوات TRP. وتشمل مزايا استخدام هذه التقنية التحكم الكامل في جهد الغشاء ونسبة إشارة إلى ضوضاء عالية للغاية والقدرة على إدخال مؤشرات محددة للقياسات البصرية.

بشكل عام، قد يواجه الأشخاص المبتدئون في هذه الطريقة صعوبة بسبب الحجم الدقيق للعينة والحاجة إلى إجراء التشريح بسرعة نظراً لوجود ضعف استقلابي مرتبط بالوقت. بالنسبة لهذا الإجراء، يتم تربية الذباب بكثافة تبلغ حوالي 20 ذبابة لكل أنبوبة. وعند وقت التجربة، يجب توفير بضع أنابيب تحتوي على خادرات على وشك الإغلاق وكانت في ظلام تام لمدة 24 ساعة على الأقل.

قبل ساعتين من جمع الحشرات البالغة، قم بإزالة أي حشرات بالغة قد خرجت من الشرنقة. تعامل دائماً مع الذباب المتكيف مع الظلام في الأنسجة تحت إضاءة الضوء الأحمر. وأثناء انتظار الذباب الخارج حديثاً من الشرنقة، قم بتجهيز غرفة التسجيل.

قم بتثبيت غطاء الشريحة في قاع الحجرة باستخدام البارافين المذاب أو شحم السيليكون المفرغ من الهواء عالي الضغط لإتمام عملية إعداد الحمام. ثم قم بتركيب الحمام على منصة المجهر المقلوب. ضع داخل الحمام أنبوب نظام التروية، وأنبوب نظام الشفط، والسلك الأرضي الخاص بتجهيزات الفيزيولوجيا الكهربائية.

قبل البدء في عملية التشريح، قم بتحضير بعض المحاليل على الجانب الخلفي لطبق بتري بقطر 60 مليمتر. ضع أربع قطرات منفصلة من ES الخالي من الكالسيوم وقطرة واحدة من TS. الآن، باستخدام ملاقط خشنة، أمسك ذبابة خرجت حديثاً من شرنقتها من أجنحتها أو جسمها. ثم باستخدام ملاقط دقيقة، افصل الرأس وانقله بسرعة إلى القطرة الأولى من ES الخالي من الكالسيوم. وتحت المجهر المجسم، قم بتشريح الرأس إلى نصفين على طول المستوى السهمي باستخدام زوج ثانٍ من الملاقط الدقيقة.

تأكد من بقاء كلتا العينين سليمتين. الآن، انقل نصف الرأس إلى قطرة ES الثانية الخالية من الكالسيوم، والنصف الآخر من الرأس إلى قطرة ES الثالثة الخالية من الكالسيوم. ثم ابدأ بتشريح إحدى العينين.

باستخدام ملاقط دقيقة، قم بإزالة أكبر قدر ممكن من الأنسجة المحيطة بالعين لضمان عدم إلحاق أي ضرر بالشبكية. بعد ذلك، أمسك حافة القرنية بإحكام باستخدام ملاقط دقيقة واستخرج الشبكية. يجب أن تكون النتيجة قرنية فارغة وسليمة منفصلة عن شبكية سليمة.

تُحفظ الماصات في الإيثانول، لذا، عند استخدام ماصة سحب (trituration pipette) جديدة، يجب شطفها دائمًا بالماء أولاً. الآن، املأ الماصة التي تم شطفها بحجم صغير من محلول ES الخالي من الكالسيوم بدءًا من القطرة الرابعة. ثم، وباستخدام سحب لطيف بالفم، اسحب الشبكية المعزولة إلى داخل الماصة.

تجنب حبس فقاعات الهواء بحذر شديد. بعد ذلك، ضع الشبكية في قطرة من TS. بعد ذلك، كرر عملية عزل الشبكية في العين الثانية بحيث تصبح كلتاهما الآن في قطرة TS. ثم امسح بعناية محلول ES الخالي من الكالسيوم فقط من طبق بتري وأضف ست قطرات إضافية من TS إلى سطح الطبق.

انقل كلتا الشبكيتين إلى قطرات جديدة من TS. ثم استبدل ماصة السحق بأخرى ذات فتحة ذات قطر صغير. بعد شطفها، املأ الماصة بقطرة من TS. وباستخدام هذه الماصة، قم بشفط وطرد كلتا الشبكيتين بسرعة وبشكل متكرر لفصل بعض العيون المركبة (ommatidia) عن الخلايا الصبغية. سيصبح محلول TS عكراً عند حدوث ذلك.

بعد ذلك، انقل بقايا كلتا الشبكيتين إلى قطرة أخرى من محلول TS. ثم، اسحب قطرة TS العكرة التي تحتوي على العوينات المعزولة باستخدام الماصة. أفرغ المحلول في غرفة الحمام. كرر هذا الإجراء باستخدام ماصات سحق ذات أقطار أصغر تدريجيًا حتى تذوب الشبكية تمامًا.

الآن، انتظر دقيقة واحدة. خلال هذا التوقف، ستلتصق العيون المركبة (ommatidia) المعزولة بقاع الحجرة. بعد مرور دقيقة، ابدأ بتدفق ES الذي يحتوي على 1.5 millimolar من الكالسيوم باستخدام نظام التروية.

أثناء ملء الحجرة، تأكد من غمر السلك الأرضي وأنبوب السحب. اترك المحلول يتدفق لمدة تتراوح من 60 إلى 90 ثانية قبل المتابعة. للبدء، استخدم العدسة الشيئية 40x لفحص العيون المركبة (ommatidia) في الحمام بدقة.

لاحظ أن أجسام الخلايا المستقبلة للضوء المستطيلة التي تشكل العين المركبة (ommatidium) منفصلة عن محاويرها ولكنها تظل حيوية. اختر الآن عيناً مركبة مناسبة للتجربة، بحيث تتوفر فيها المعايير التالية.

يجب أن يكون الغشاء الخارجي أملس وسليماً. كما يجب أن يكون المحور الطولي عمودياً تقريباً بالنسبة لاتجاه اقتراب القطب الكهربائي من الجانب القاصي. ويجب ألا تكون العوينة محاطة بأي أنسجة زائدة.

بمجرد الاختيار، قم بتوسيط العُيينة (ommatidium) في مجال الرؤية. الآن، املأ ماصة بالمحلول داخل الخلوي المناسب للتجربة. ثم قم بتدوير الماصة نحو حامل القطب الكهربائي.

بعد ذلك، انفخ في أنبوب الماصة لإنشاء ضغط موجب، ثم قم بتثبيت الضغط عن طريق إغلاق صمام الأنبوب. بعد ذلك، أدخل الماصة في غرفة الحمام ووجهها بالقرب من الجزء البعيد من العيين (ommatidium) حتى تلاحظ وجود انبعاج صغير في الغشاء، وهو ناتج عن الضغط الموجب من الماصة المثبتة. الآن، افتح وحدة اختبار الغشاء في برنامج التسجيل لتطبيق نبضات جهد مربعة مستمرة بقيمة 2 mV وبمعدل 100 Hz.

بعد ذلك، وباستخدام عناصر التحكم في مضخم تثبيت الرقعة (patch clamp amplifier)، اضبط جهد الوصلة على صفر لضبط قاعدة النبضة المربعة على تيار صفري. ثم افتح الصمام لتحرير الضغط في الماصة وقم بالشفط بلطف لإنشاء ضغط سلبي. ومن ثم، يجب أن تلتصق الماصة بغشاء الخلية.

بمجرد حدوث ذلك، أغلق الصمام للحفاظ على الضغط. الآن افحص مقاومة القطب الكهربائي؛ إذ يجب أن ترتفع لتصبح بين 100 و 150 megaohms.

بعد ذلك، قم بتحرير الضغط السلبي في الماصة عن طريق فتح الصمام مرة أخرى. من المفترض أن ترتفع المقاومة الآن لتصل إلى ما بين 1 و 2 gigaohms، مما يشير إلى تشكل اتصال C بين الماصة والخلية. بعد ذلك، وباستخدام مضخم patch clamp، قم بإزالة تيار السعة الخاص بالماصة.

لإنشاء تكوين الخلية الكاملة، قم بتمزيق غشاء الخلية باستخدام الشفط الفموي. قم بإحداث نبضات قصيرة وسريعة وقوية من الضغط السلبي في القطب الكهربائي. عند الوصول إلى تكوين الخلية الكاملة، ستحدث زيادة مفاجئة في السعة الكهربائية.

ثم باستخدام مضخم تثبيت الرقعة (patch clamp amplifier)، اضبط جهد التثبيت على الجهد المطلوب وقم بمعادلة التيارات السعوية في مقاومة التوالي. الآن أغلق الستارة الفرنسية السوداء لقفص فاراداي وابدأ التجربة. بعد الحصول على تهيئة الخلية الكاملة باستخدام ماصة رقعة تحتوي على الصبغة الفلورية، Lucifer yellow، يمكن ملاحظة أن واحدًا فقط من المستقبلات الضوئية المكونة للعينيّة (ommatidium) قد تم تحميله بالصبغة.

سيكون هذا المستقبل الضوئي معزولاً كهربائياً أيضاً عن جيرانه في العين المركبة (ommatidium). وقد أظهرت العيون المركبة التي خضعت لتثبيت الجهد للخلية الكاملة (Whole-cell voltage clamped ommatidia) في الذباب من النوع البري والذباب الذي يحمل طفرات في جينات InaC أو InaD نتوءات كمومية (quantum bumps) استجابةً للضوء الخافت المستمر. ولوحظ إنهاء بطيء لهذه النتوءات في كلا الطفرتين مقارنة بالذباب من النوع البري.

توضح الاستجابات المعيرة لنبضات ضوئية مدتها 500 millisecond تم تقديمها بمعدل 150,000 photons per second الفسيولوجيات المتغيرة بشكل دقيق. وباستخدام هذا التحضير، أمكن قياس استجابات القفزة الكمومية (quantum bump) بجهد مثبت للخلية الكاملة (whole-cell voltage clamped) لنبضة ضوء خافتة قصيرة مدتها one millisecond. وقد تمت مقارنة هذه الاستجابات للفوتون الواحد في ذباب من النوع البري (wild type)، وذباب طافر في بروتين arrestin، وذباب طافر في ninaC.

استجاب كلا الطفرتين بسلسلة من النتوءات. تم تطبيع الاستجابات لنبضة ضوئية مدتها 500 millisecond سُلِّمَت بمعدل 15,000 photons per second. وبذلك، يُلاحظ الإنهاء البطيء للاستجابة العيانية في طفرات arrestin-2 و ninaC.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يتكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء تسجيلات الخلية الكاملة من الخلايا المستقبلة للضوء في ذبابة Drosophila. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إنجازها في غضون ساعة واحدة إذا نُفذت بشكل صحيح. لقد مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين لفهم قنوات TRP وإشارات إينوزيتول ليبيد بشكل أفضل، بالإضافة إلى دور الخلايا العقدية الشبكية الحساسة للضوء ذاتياً الموجودة في الثدييات، والتي تشارك في الأنشطة المعتمدة على الضوء وغير المكونة للصور.