طرق لتصنيف البؤر السيتوبلازمية كما حبيبات الإجهاد الثدييات

حبيبات الإجهاد (سغس) هي الهياكل السيتوبلازمية غير الغشائية التي تشكل في الخلايا المعرضة لمجموعة متنوعة من الضغوط. سغس تحتوي على مرناس، والبروتينات ملزم رنا، الوحدات الفرعية الريباسي الصغيرة، العوامل المرتبطة الترجمة، والبروتينات خلية إشارة مختلفة. يصف هذا البروتوكول سير العمل الذي يستخدم العديد من النهج التجريبية للكشف عن، وتحديد، وتحديد الكميات سغس حسن النية .

الهدف العام من سير العمل هذا هو تحديد ما إذا كانت البؤر المحددة داخل السيتوبلازم هي حبيبات إجهاد حسنة النية وهي حبيبات الحمض النووي الريبي التي تلعب أدوارا مهمة في فسيولوجيا الخلية. الميزة الرئيسية لسير العمل هذا هي أنه يختبر جميع الخصائص الأساسية لحبيبات الإجهاد. على الرغم من أن سير العمل هذا يتم تقديمه لخلايا الساركوما العظمية البشرية U-2 OS ، إلا أنه يمكن تطبيقه أيضا على أنواع أخرى من خطوط الخلايا والخلايا الأولية.

بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأنه ليست كل البؤر الناجمة عن الإجهاد هي حبيبات الإجهاد. يشتمل سير عملنا على جميع التجارب اللازمة لتمييزها. سأعرض هذا الإجراء مع Anais Aulus.

نحن زملاء ما بعد الدكتوراه في مختبر بول أندرسون وبافيل إيفانوف. للبدء ، توضع خلايا البذور على أغطية في 24 لوحة بئر كما هو موضح في بروتوكول النص. بعد الحضانة الليلية ، قم بشفط وسائط الاستزراع من الآبار B1 إلى B4 ومن C1 إلى C4 من لوحة 24 بئر.

أضف 500 ميكرولتر من الوسط المكمل ب 100 ميكرومولار من زرنيخيت الصوديوم إلى الآبار B1 و B2 ، ثم أضف 500 ميكرولتر من الوسط المكمل ب 50 ميكرومولار زرنيخيت الصوديوم إلى الآبار B3 و B4. بعد ذلك ، أضف 500 ميكرولتر من الوسط الذي يحتوي على 150 ميكرومولار فينوريلبين إلى الآبار C1 و C2. أخيرا ، أضف 500 ميكرولتر من الوسط المكمل ب 125 ميكرومولار من vinorelbine إلى الآبار C3 و C4. احتضن الطبق لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. بعد 30 دقيقة من الحضانة ، أضف إلى الخلايا في العمود اثنين خمسة ميكرولتر من مليغرام واحد لكل مليلتر محلول سيكلوهيكسيميد وإلى الخلايا الموجودة في العمود الرابع ، ميكرولترين من 1.25 ملليغرام لكل مليلتر بورومايسين. رج الطبق برفق لخلط المحاليل وأعد الطبق إلى الحاضنة لمدة 30 دقيقة إضافية من الحضانة.

لإصلاح الخلايا ، قم بإزالة الوسائط من الآبار وغسل الخلايا بحوالي 250 ميكرولتر من PBS. أضف ما يقرب من 250 ميكرولترا من محلول بارافورمالدهايد مخزن 4٪ لإصلاح الخلايا ، مع التأكد من تغطية الجزء العلوي من الغطاء بالكامل. ثم اترك الطبق على مقاعد البدلاء في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.

بعد ذلك ، قم بإزالة والتخلص من بارافورمالدهيد بشكل صحيح. أضف ما يقرب من 250 ميكرولتر من الميثانول المثلج لاختراق الخلايا وتسطيحها. احتضان اللوحة لمدة خمس دقائق إضافية في درجة حرارة الغرفة على هزاز.

بمجرد اكتمال النفاذية ، تخلص من الميثانول وسد الخلايا عن طريق تطبيق ما يقرب من 250 ميكرولتر من المخزن المؤقت المانع لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، قم بإعداد محلول الجسم المضاد الأساسي عن طريق إضافة 12 ميكرولترا من الأجسام المضادة ضد G3BP1 eIF4G و eIF3B إلى ثلاثة ملليلتر من المخزن المؤقت المانع. أضف 250 ميكرولترا من محلول الجسم المضاد إلى كل بئر من لوحة 24 بئر.

احتضن اللوحة على الروك لمدة ساعة على الأقل في درجة حرارة الغرفة. بعد ساعة واحدة من الحضانة ، قم بإزالة محلول الجسم المضاد واغسل الخلايا بحوالي 250 ميكرولتر من PBS لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، أضف 12 ميكرولترا من الأجسام المضادة Anti-Mouse Cy2 و Anti-Rabbit Cy3 و Anti-Goat Cy5 جنبا إلى جنب مع ثلاثة ميكرولترات من صبغة الخطافات إلى ثلاثة ملليلتر من المخزن المؤقت المانع لتحضير محلول الأجسام المضادة الثانوية.

أضف 250 ميكرولترا من محلول الجسم المضاد الثانوي إلى كل بئر وقم بتغطية اللوحة لحماية العينات من الضوء. احتضان اللوحة على الروك في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. عند اكتمال الحضانة ، قم بإزالة محلول الجسم المضاد وغسل الخلايا باستخدام PBS لمدة خمس دقائق.

وسط تركيب الحرارة في كتلة حرارية 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق لتقليل اللزوجة. ثم باستخدام طرف ماصة مسبق القطع سعة 200 ميكرولتر ، ضع 25 ميكرولترا من وسط التركيب على شريحة زجاجية مكتوبة. باستخدام ملقط دقيق ، انقل الغطاء من البئر إلى الشريحة ، مع عكس الجزء العلوي بحيث تواجه الخلايا وسط التثبيت.

استخدم طرف P200 نظيفا للضغط على الغطاء لأسفل. بمجرد تركيب جميع أغطية الغطاء ، قم بإزالة وسط التثبيت الزائد عن طريق الضغط على منديل المختبر بقوة على الشريحة. بعد ذلك ، اغسل الشريحة بالماء.

وصمة عاره على الفور بأنسجة المختبر مرة أخرى. قم باختراق الخلايا المسبوقة عن طريق احتضانها ب 250 ميكرولتر من الميثانول المثلج في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، أضف إلى الآبار التي تم إفراغها من اللوحة ما يقرب من 250 ميكرولتر من 70٪ من الإيثانول وأغلق اللوحة باستخدام البارافيلم لمنع التبخر.

احتضن الطبق عند أربع درجات مئوية طوال الليل. بعد الحضانة الليلية ، قم بإزالة الإيثانول وإعادة ترطيب الخلايا بإضافة 500 ميكرولتر من 2XSSC. احتضن الغطاء لمدة خمس دقائق على الروك في درجة حرارة الغرفة.

ثم تخلص من المحلول وأضف 500 ميكرولتر من SSC مرة أخرى. احتضن الطبق لمدة خمس دقائق إضافية مع تحريك لطيف. بعد ذلك ، ضع طبقة من البارافيلم في قاع فرن التهجين وماصة 25 ميكرولترا من مخزن التهجين فوقه.

انقل الغطاء من لوحة 24 بئر ، مع عكس الجزء العلوي بحيث تواجه الخلايا المخزن المؤقت للتهجين. احتضن الغطاء عند 42 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. ماصة 25 ميكرولتر من محلول البيوتين oligo dT على البارافيلم في فرن التهجين.

بعد ذلك ، باستخدام الملقط ، التقط الغطاء وصمة عار حافته على أنسجة المختبر لإزالة المخزن المؤقت التهجين الزائد. انقل الغطاء إلى محلول البيوتين oligo dT ، وتأكد من أن الخلايا مقلوبة لأسفل وتحتضن عند 42 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة. بمجرد اكتمال التهجين ، أضف ما يقرب من 500 ميكرولتر من 2XSSC الدافئ مسبقا إلى آبار طبق 24 بئر.

ثم ، باستخدام الملقط ، انقل الغطاء إلى البئر واحتضانه عند 42 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. بعد تلطيخ الخلايا بمحلول الأجسام المضادة ، اعرض العينات باستخدام المجهر الفلوري. معروضة هنا صور لخلايا U-2 OS غير المعالجة التي لا تحتوي على أي حبيبات أو بؤر ملطخة بعلامات حبيبات الإجهاد G3BP1 و eIF4G و eIF3B.

في خلايا U-2 OS المعالجة بزرنيخيت الصوديوم أو vinorelbine ، تم تحفيز تكوين بؤر السيتوبلازمية التي تحتوي على G3BP1 و eIF4G و eIF3B. تم تأكيد التوطين المشترك لهذه العلامات من خلال تحليل مسح الخط الذي تم إجراؤه لكل قناة عند زيادة التكبير متبوعا بفرض فائق للرسوم البيانية التي تم الحصول عليها. بالإضافة إلى ذلك ، احتوت البؤر السيتوبلازمية المحددة في الخلايا المعالجة على mRNA كما هو موضح في poly A FISH.

تم تحديد إشارة oligo dT مع إشارة G3BP1 التي تؤكد تحديد حبيبات الإجهاد. بمجرد إتقانها ، يمكن تنفيذ سير العمل بالكامل في ثلاثة أيام إذا تم تنفيذه بشكل صحيح. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء التألق المناعي والتهجين الفلوري.

الخطوات الحاسمة للتوصيف الصحيح وتحديد حبيبات الإجهاد. لا تنس أن العمل مع بارافورمالدهيد قد يكون خطيرا للغاية. يجب دائما استخدام الاحتياطات مثل استخدام معدات الوقاية الشخصية والتهوية الكافية أثناء تنفيذ هذا الإجراء.