فلاش وتجميد: تقنية جديدة لالتقاط غشاء حيوية مع المجهر الإلكتروني

الهدف العام من هذا الإجراء هو التقاط ديناميكيات الغشاء عن طريق المجهر الإلكتروني بعد تحريض النشاط العصبي باستخدام علم البصريات الوراثي ثم تجميد الخلايا في نقاط زمنية محددة بعد التحفيز. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في علم الأعصاب وبيولوجيا الخلية حول آليات إعادة تدوير الحويصلة المشبكية وربما أيضا النمذجة على نطاق زمني سريع جدا. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي القدرة على تصور التغيرات المورفولوجية داخل الخلية باستخدام المجهر الإلكتروني على مقياس زمني بالمللي ثانية.

سيتم عرض الإجراء من قبل شو لي ، طالب دراسات عليا وسومانا رايتشودري ، باحث مشارك. كلاهما من مختبري. قبل تحضير المثبت ، قم بتسمية ملفين مليلترين المبردين بقلم رصاص وفقا لأرقام عيناتهما.

ثم اجمع بين جميع الكواشف المثبتة ، وقم بتقسيم مليلتر واحد من أحجام المثبت في كل قارورة. بعد تغطية الأنابيب ، اغمر المثبتات على الفور في النيتروجين السائل وقم بتخزين القوارير في صندوق ستايروفوم مغلق. بعد ذلك ، املأ وحدة استبدال مجانية آلية ومجمد عالي الضغط بالنيتروجين السائل.

ثم ضع وعاءا صغيرا من الأسيتون في غرفة العينة لوحدة الاستبدال الحرة وانتظر حتى تصل درجة حرارة وحدة الاستبدال إلى 90 درجة مئوية تحت الصفر. لبرمجة بروتوكول تحفيز الضوء، انقر فوق تحرير في نافذة تحفيز الضوء بشاشة اللمس. سيتم فتح نافذة أخرى.

أدخل 15 ثانية للمرحلة المظلمة. 100 مللي ثانية للفترة. 10 مللي ثانية للنبض، وواحد لعدد الفترات لحافز واحد مدته 10 مللي ثانية.

على الشاشة الرئيسية، تأكد من تحديد مربع تحفيز الضوء، وانقر فوق تخزين العينة متبوعا بتحرير. في النافذة الجديدة ، استخدم زر الجمع أو الطرح لتحديد عينتين لتخزين عينتين في كل قناة والتأكد من اختيار تمكين النيتروجين السائل للتخزين. الآن تحت مجهر استريو ، ضع جانب خلية قرصية من الياقوت لأعلى في بئر صفيحة سوداء متوسطة.

تليها حلقة فاصل 100 ميكرون. اغمس جانبا واحدا من قرص الياقوت الفارغ في محلول ملحي دافئ مسبقا وضع القرص فوق حلقة الفاصل ، بحيث يكون الجانب الملحي لأسفل. ضع حلقة فاصل أخرى 100 ميكرون.

وحلقة فاصلة 400 ميكرون أعلى آخر قرص من الياقوت ، واستخدم ورق الترشيح لإزالة أي سائل زائد. أثناء حمل العينات ، تأكد من عدم حبس أي فقاعات هواء بين أقراص الياقوت. ثم ضع المجموعة بأكملها بين الأسطوانتين النصفيتين الشفافتين وأغلق الغطاء الأحمر العلوي لبدء عملية التجميد.

سيظهر الغطاء الأحمر احتياطيا تلقائيا بمجرد اكتمال عملية التجميد. عندما يتم تجميد جميع العينات ، افتح باب ديوار التخزين وانقل الديوار إلى سطح الطاولة. انقل حجرة العينة من ديوار التخزين إلى صينية عينات متخصصة مملوءة بالنيتروجين السائل.

وافتح المقبض لتحرير كوب العينة. ثم استخدم زوجا من الملقط مع أطراف مبردة بالنيتروجين السائل لإزالة نصف الأسطوانات الشفافة من كوب العينة. وانقل الألواح السوداء الوسطى بعناية إلى كوب صغير يحتوي على النيتروجين السائل.

احرص على إبقاء العينات المجمدة تحت النيتروجين السائل في جميع الأوقات ، والحفاظ دائما على التعامل مع العينات باستخدام ملاقط مبردة مسبقا. قم بتبريد الملقط مسبقا مرة أخرى ، وانقل اللوحة الوسطى الأولى بسرعة إلى الأسيتون المبرد مسبقا. رج اللوحة برفق والنقر عليها لفصل قرص الياقوت عن اللوحة.

ثم ضع ملفا مبردا مفتوحا من المثبت في غرفة العينة في وحدة الاستبدال. انقل قرص الياقوت إلى القارورة. وقم بتغطية القارورة على الفور.

عندما يتم نقل جميع العينات ، قم بتعيين معلمات برنامج الاستبدال المجاني المناسبة وابدأ البرنامج. في نهاية برنامج الاستبدال المجاني ، استخدم القفازات لنقل الملفات المبردة من غرفة العينة إلى غطاء كيميائي واستخدم ماصة لإضافة الأسيتون بدرجة حرارة الغرفة إلى كل قارورة. استبدل الغسيل في كل قارورة بالأسيتون الطازج أربع إلى ست مرات خلال فترة ساعة إلى ساعتين.

ثم أضف راتنجات الايبوكسي المحضرة حديثا بنسبة 30٪ إلى كل قارورة لمدة ساعتين إلى ثلاث ساعات في درجة حرارة الغرفة في شاكر مداري عند 120 دورة في الدقيقة. في نهاية الحضانة ، استبدل راتنجات الايبوكسي بنسبة 30٪ براتنجات إيبوكسي بنسبة 70٪ لمدة ثلاث إلى أربع ساعات على شاكر المدار. ثم استخدم الملقط لنقل كل قرص ، بحيث يكون جانب الخلية لأعلى ، إلى غطاء كبسولة التضمين وإضافة 90٪ من راتنجات الايبوكسي إلى الأقراص لحضانة ليلية عند أربع درجات مئوية.

في صباح اليوم التالي ، انقل كل قرص من الياقوت إلى غطاء كبسولة تضمين جديدة ، واملأ الغطاء براتنجات الايبوكسي المحضرة حديثا بنسبة 100٪. بعد آخر حضانة راتنجات الايبوكسي بنسبة 100٪ ، قم ببلمرة العينات في فرن 60 درجة مئوية لمدة 48 ساعة. عندما تتبلمر العينات ، ضع العينة الأولى رأسا على عقب على المجهر الاستريو بحيث يكون قرص الياقوت موجودا في الجزء العلوي من كتلة الراتنج ، واستخدم شفرة حلاقة لإزالة طبقة رقيقة من الراتنج من أعلى العينة.

بعد ذلك ، استخدم شفرة الحلاقة لقطع خط ضحل على طول حافة القرص لفصل قرص الياقوت عن راتنجات الايبوكسي. واغمس القرص في النيتروجين السائل لمدة 10 ثوان تقريبا لفصل القرص عن باقي الراتنج. انقل الراتنج تحت مجهر تشريح ، وقم بلصق العينة على مرحلة المجهر.

باستخدام تكبير من أربعة إلى 10 أضعاف ، ابحث عن منطقة بها خلايا واستخدم شفرة حلاقة ذات حدين لقطع مساحة بحجم ملليمترين في ملليمترين حول منطقة الاهتمام. ثم استخدم الغراء الفائق لتركيب الخلايا على كتلة وهمية أسطوانية مصنوعة من راتنجات الايبوكسي ، واحتضان الكتلة عند 60 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. بعد التقسيم على مجلد فائق الصغر ، انقل العينات إلى مجهر إلكتروني ناقل للتصوير بتكبير 930 ، 000X.

في هذه الصورة ، تم تسجيل اندماج الحويصلة المشبكية عن طريق إفراز الخلايا بعد 15 مللي ثانية من ظهور الضوء داخل المنطقة النشطة لغشاء ما قبل المشبكي في الخلايا العصبية الحصين للفأر. بعد 100 مللي ثانية من بداية الضوء ، يمكن ملاحظة حفرة خلوية مجاورة للمنطقة النشطة ، مما يوضح الالتقام الخلوي فائق السرعة بواسطة الخلية العصبية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية معالجة العينات باستخدام تجارب الفلاش والتجميد.

تذكر أن العمل مع الجلوتارالديهايد ورباع أكسيد الأوزميوم والنيتروجين السائل يمكن أن يكون خطيرا حقا ، لذا تأكد من ارتداء ملابس واقية. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء جزء التجميد من هذه الإجراءات في غضون ساعتين ل 12 عينة ، ولكن باقي الإجراءات بما في ذلك التصوير وتحليل الصور يمكن أن تستغرق ما يصل إلى أيام أو أسابيع أو حتى شهور ، وبالتالي يمكن أن تكون إجراءات طويلة حقا. إذا قمت بتوطين البروتينات ، أو تصور ديناميكياتها ، فيمكنك أيضا استخدام بروتوكولات مختلفة للحفاظ على المستضدة ، أو اللؤلؤ من البروتينات اللؤلؤية وتصور ديناميكياتها باستخدام هذه التقنيات.