Glycoproteomics من مصفوفة خارج الخلية: منهج في تحليل سكري سليمة عن طريق قياس الطيف الكتلي

الهدف العام من هذا البروتوكول هو تحليل تكوين بروتين المصفوفة خارج الخلية بما في ذلك تحديد مواقع الارتباط بالجليكوزيل والتوصيف التركيبي لأشكال الجليكان في أنسجة القلب والأوعية الدموية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في عملية تليف الأنسجة ، مثل كيفية تأثير الجليكوستلات الهيكلية على تليف الأنسجة أثناء أمراض القلب والأوعية الدموية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه على عكس البروتوكولات السابقة التي تحلل التغيرات الإجمالية في الارتباط بالجليكوزيل ، فإنها تسمح بتوصيف الارتباط بالجليكوزيل في مواقع معينة لبروتينات المصفوفة الهيكلية ، مما يوفر أداة لمتابعة دراسات ميكانيكية أكثر استهدافا.

ستظهر الإجراءات الدكتورة ماريكا فافا والسيدة فرهين بيج من مختبرنا. لبدء هذا الإجراء، قم بإعداد جميع المخازن المؤقتة للاستخراج كما هو موضح في بروتوكول النص. بعد ذلك ، استخدم مشرطا لتقطيع 20 إلى 50 ملليغرام من الأنسجة إلى ثلاث أو أربع قطع أصغر حجمها حوالي ملليمترين.

ضع الأنسجة المقطعة في أنبوب سعة 1.5 مليلتر وأضف 500 ميكرولتر من PBS المثلج. اغسل المناديل خمس مرات باستخدام 500 ميكرولتر من PBS لكل غسلة لتقليل تلوث الدم. انقل العينات المغسولة إلى أنبوب سعة 1.5 مليلتر بغطاء لولبي وأضف حجما من محلول كلوريد الصوديوم 10 أضعاف وزن الأنسجة.

دوامة بأقل سرعة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. ثم انقل المستخلص إلى أنابيب طرد مركزي جديدة وأجهزة طرد مركزي عند 16 ، 000 مرة G لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. اغسل حبيبات الأنسجة الناتجة لفترة وجيزة باستخدام عازلة كلوريد الصوديوم الطازجة.

بعد ذلك ، أضف حجما من المخزن المؤقت SDS 10 أضعاف وزن الأنسجة والدوامة بأقل سرعة لمدة 16 ساعة في درجة حرارة الغرفة. انقل المستخلص إلى أنابيب طرد مركزي جديدة وأجهزة طرد مركزي عند 16 ، 000 مرة جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. اغسل الكريات الناتجة بالماء المقطر المزدوج.

أضف حجما من محلول غوانيدين هيدروكلوريد خمسة أضعاف وزن الأنسجة والدوامة بأقصى سرعة لمدة 72 ساعة في درجة حرارة الغرفة. انقل المستخلص الناتج إلى أنابيب جديدة وأجهزة طرد مركزي عند 16،000 مرة G لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. بعد تحديد كمية البروتين ، قم بنقل 10 ميكروغرام إلى أنبوب جديد لكل عينة ، لتقييم إشغال موقع الغليكوزيلات و 50 ميكروغراما إلى أنبوب منفصل لتحليل الجليكوببتيد المباشر.

أضف 10 أضعاف حجم الإيثانول إلى كل منها واحتضنه طوال الليل عند 20 درجة مئوية. في اليوم التالي ، قم بالطرد المركزي للعينات عند 16،000 مرة G لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية. شفط المادة الطافية ، مع الحرص على عدم إزعاج الحبيبات المترسبة.

ثم استخدم مكثف فراغ لتجفيف الكريات لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. أضف 10 ميكرولتر من محلول إزالة السكر المحضر إلى كل عينة. قم بتعبئة أنابيب العينة داخل أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر واحتضانها بزاوية 45 درجة لمدة ساعتين عند 25 درجة مئوية.

بعد ذلك ، ارفعي درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية واحتضنها لمدة 36 ساعة مع تحريض لطيف. بعد الطرد المركزي عند 16 ، 000 مرة G لمدة دقيقة واحدة ، استخدم مكثف فراغ في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة لتبخر الماء. أعد تعليق العينات المجففة ب 10 ميكرولتر من الماء الملصق O-18 الذي يحتوي على 50 وحدة لكل مليلتر PNGase F.احتضن لمدة 36 ساعة عند 37 درجة مئوية تحت التحريك المستمر ثم قم بإجراء هضم التربسين في المحلول لجميع العينات والمضي قدما في تنظيف C-18.

للبدء ، أضف 200 ميكرولتر من الميثانول إلى كل بئر من لوحة الدوران C-18 لتنشيط الراتنج. جهاز طرد مركزي عند 1 ، 000 مرة G لمدة دقيقة واحدة. ثم أضف 200 ميكرولتر من 80٪ ACN و 0.1٪ TFA في الماء إلى كل بئر وجهاز طرد مركزي عند 1 ، 000 مرة G لمدة دقيقة واحدة.

بعد ذلك ، أضف 200 ميكرولتر من محلول يحتوي على 1٪ ACN و 0.1٪ TFA في الماء لكل بئر ، وجهاز طرد مركزي لمدة دقيقة واحدة عند 1 ، 000 مرة G. كرر إضافة هذا المحلول والطرد المركزي مرتين. بعد ذلك ، قم بتحميل العينات في آبار لوحة الدوران وأجهزة الطرد المركزي عند 1500 مرة G لمدة دقيقة واحدة. أعد تحميل التدفق من خلال وكرر الطرد المركزي.

ثم أضف 200 ميكرولتر من محلول يحتوي على 1٪ ACN و 0.1٪ TFA في الماء لكل بئر ، وجهاز طرد مركزي عند 1500 مرة G لمدة دقيقة واحدة. كرر إضافة هذا المحلول والطرد المركزي مرتين. بعد ذلك ، أضف 170 ميكرولترا من محلول يحتوي على 50٪ ACN و 0.1٪ TFA في الماء لكل بئر وجهاز طرد مركزي عند 1500 مرة G لمدة دقيقة واحدة.

كرر هذه الإضافة والطرد المركزي مرة أخرى. استخدم مكثف فراغ لتجفيف الشطف المركب في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين. قم بتخزين العينات المجففة على حرارة 80 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة للاستخدام.

بعد ذلك ، قم بإجراء تحليل مطياف الكتلة الترادفي للكروماتوغرافيا السائلة على العينات المخصصة لتقييم إشغال الجليكوسايت. بالنسبة للعينات المخصصة لتحليل الببتيد الجليكوبتيد المباشر ، تابع أولا وضع العلامات الصفرية القياسية TMT كما هو موضح في بروتوكول النص. للبدء ، أضف إلى كل 10 ميكرولترات من عينة TMT الصفرية 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت الملزم.

بعد ذلك ، قم بنقل 50 ميكرولتر من تعليق راتنج التقاط الجليكو المتجانس إلى أنابيب جديدة سعة 1.5 مليلتر وجهاز طرد مركزي لمدة دقيقة واحدة عند 2500 مرة G.قم بإزالة المادة الطافية وأضف 60 ميكرولترا من العينة ومحلول المخزن المؤقت الملزم إلى الأنابيب التي تحتوي على كريات الراتنج باستخدام ماصة للخلط. احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة مع التقليب عند 1200 دورة في الدقيقة. بعد الطرد المركزي لمدة دقيقتين عند 2 ، 000 مرة ، قم G بنقل المادة الطافية إلى أنابيب جديدة.

بعد ذلك ، أضف 150 ميكرولتر من محلول الغسيل إلى كل أنبوب راتنج باستخدام الماصة للخلط لبدء عملية الغسيل. احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق مع التقليب عند 1200 دورة في الدقيقة. بعد الطرد المركزي عند 2500 مرة G لمدة دقيقتين ، انقل كل مادة طافية إلى أنبوب تخزين الطاف المقابل لإكمال الغسيل.

كرر عملية الغسيل هذه مرتين أخريين. بعد ذلك ، أضف 75 ميكرولترا من محلول الشطف واخلطه مع ماصة. احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق أثناء التقليب عند 1200 دورة في الدقيقة.

جهاز طرد مركزي عند 2500 مرة G لمدة دقيقتين ونقل كل مادة طافية إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مل. أضف 75 ميكرولترا من محلول الشطف باستخدام ماصة للخلط ثم كرر الحضانة والطرد المركزي للعينات. انقل كل مساء إلى الأنبوب المقابل.

بعد الطرد المركزي ، قم بعمل طرد مركزي ، لمدة دقيقتين عند 2500 مرة ، قم بنقل كل مادة طافية إلى أنبوب جديد لضمان الإزالة الكاملة للراتنج. بعد ذلك ، استخدم مكثف فراغ لتجفيف المحلول لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. أعد تعليق الجليكوببتيدات المجففة في 15 ميكرولترا من 2٪ ACN و 05٪ TFA في الماء المقطر المزدوج.

بعد ذلك ، قم بإجراء تحليل قياس الطيف الكتلي كما هو موضح في بروتوكول النص. في هذه الدراسة ، يتم تحضير بروتينات ECM من أنسجة القلب والأوعية الدموية لتحليل مطياف الكتلة الترادفي للكروماتوغرافيا السائلة لتكوين ECM بالإضافة إلى تحليل الجليكوببتيد غير المباشر والمباشر. تعتمد الاستراتيجية الأساسية على الحضانات المتسلسلة مع كلوريد الصوديوم و SDS وهيدروكلوريد غوانادين متبوعا بتحليل الجليكوببتيد غير المباشر أو المباشر.

تتم مراقبة كفاءة الاستخراج على المواد الهلامية bis-tris acrylamide مع تلطيخ الفضة للتصور. من بين المستخلصات الثلاثة التي يتم تشغيلها ، تظهر غالبية البروتينات السكرية ECM في حصص هيدروكلوريد غوانادين. تم تزيين البروتينات السكرية ECM بسلاسل جليكوسامين جليكوسامين كبيرة ومتكررة جنبا إلى جنب مع السكريات قليلة السكاريد القصيرة والمتنوعة المرتبطة ب N و O.

تظهر كفاءة إزالة الجليكوزيل من خلال إضافة الإنزيمات التي تهضم الجليكانات والإنزيمات التي تستهدف السكريات قليلة السكاريد الأصغر المرتبطة ب N و O. ثم يتم تحديد البروتينات السكرية من خلال وجود الهليونات منزوعة الدقة المسمى بالأكسجين 18 داخل سيكونات NXT أو NXS. يظهر هنا طيف كتلي ترادفي تمثيلي HCD لببتيد ديكورين مع أسباراجين منزوع الأمين في الموضع الثاني 11.

ثم يتم استخدام تجزئة HCD ETD لتحليل مستخلص ECM المخصب بالبروتين السكري. يسمح طيف الكتلة الترادفي ETD بتوصيف تكوين الجليكان. بمجرد إتقانها ، يجب أن تستغرق هذه التقنية ما يقرب من أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع.

تسمح لنا هذه الجراحة السكرية باستكشاف الوظيفة الفسيولوجية والمرضية للتليف ليس فقط على التغيرات في البروتينات ولكن أيضا على تكوين السكريات الفكرية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير عينات لدراسة في ارتباط البروتين عن طريق قياس الطيف الكتلي. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لأمراض القلب والأوعية الدموية ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على أمراض أخرى في حجم التليف مثل أمراض الجهاز التنفسي أو السرطان.