Glycoproteomics من مصفوفة خارج الخلية: منهج في تحليل سكري سليمة عن طريق قياس الطيف الكتلي

الهدف العام من هذا البروتوكول هو تحليل تكوين بروتينات المصفوفة خارج الخلوية، بما في ذلك تحديد مواقع الغلوزة (glycosylation) والتوصيف التركيبي لأشكال الغليكان في الأنسجة القلبية الوعائية. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في عملية تليف الأنسجة، مثل كيفية تأثير غلوزة المصفوفة الهيكلية على تليف الأنسجة أثناء الإصابة بأمراض القلب والأوعية الدموية. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنها تتيح توصيف الغلوزة في مواقع محددة من بروتينات المصفوفة الهيكلية، على عكس البروتوكولات السابقة التي تحلل تغيرات الغلوزة الإجمالية، مما يوفر أداة لدراسات ميكانيكية لاحقة أكثر استهدافاً.

ستقوم الدكتورة ماريكا فافا والآنسة فهرين بيج من مختبرنا بتوضيح الإجراءات. لبدء هذا الإجراء، قم بتحضير جميع محاليل الاستخلاص المنظمة كما هو موضح في البروتوكول النصي. بعد ذلك، استخدم مشرطًا لتقطيع 20 إلى 50 مليجرام من النسيج إلى ثلاث أو أربع قطع أصغر بحجم يبلغ حوالي 2 مليمتر.

ضع النسيج المقطع إلى مكعبات في أنبوب سعة 1.5 milliliter وأضف 500 microliters من PBS المبرد بالثلج. اغسل النسيج خمس مرات باستخدام 500 microliters من PBS في كل غسلة لتقليل تلوث الدم. انقل العينات المغسولة إلى أنبوب سعة 1.5 milliliter ذو غطاء لولبي وأضف حجماً من منظم كلوريد الصوديوم يعادل 10 أضعاف وزن النسيج.

قم بالرج على جهاز الفورتكس بأدنى سرعة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، انقل المستخلص إلى أنابيب طرد مركزي جديدة وقم بإجراء الطرد المركزي عند 16,000 ×g لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة أربع درجات مئوية. اغسل كتل الأنسجة الناتجة سريعاً باستخدام محلول منظم من كلوريد الصوديوم الطازج.

بعد ذلك، أضف حجماً من منظم SDS يعادل 10 أضعاف وزن النسيج، ثم قم بالرج الدوامي (vortex) بأدنى سرعة لمدة 16 ساعة في درجة حرارة الغرفة. انقل المستخلص إلى أنابيب طرد مركزي جديدة، ثم قم بإجراء الطرد المركزي بسرعة 16,000 ×g لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة 4 °C. اغسل الرواسب الناتجة باستخدام ماء مقطر مرتين.

أضف حجماً من محلول الغوانيدين هيدروكلوريد المنظم يعادل خمسة أضعاف وزن النسيج، ثم قم بالرج الدوامي (vortex) بالسرعة القصوى لمدة 72 ساعة في درجة حرارة الغرفة. انقل المستخلص الناتج إلى أنابيب جديدة وقم بالطرد المركزي عند 16,000 ×g لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة 4 °C. بعد تقدير كمية البروتين، وزع 10 µg في أنبوب جديد لكل عينة لتقييم إشغال مواقع الغلكزة، و50 µg في أنبوب منفصل للتحليل المباشر للببتيدات السكرية.

أضف 10 أضعاف حجم الإيثانول إلى كل منها واحضنها طوال الليل عند 20 درجة مئوية. وفي اليوم التالي، قم بمركزة العينات عند 16,000 ×g لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية. اسحب السائل الطافي، مع الحرص على عدم تعكير الراسب المترسب.

ثم استخدم مكثفاً تفريغياً لتجفيف الكريات لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. أضف 10 µL من محلول منظم إزالة الغليكوزيل المُحضّر إلى كل عينة. ضع أنابيب العينات داخل أنبوب مخروطي سعة 50 mL وحضنها بزاوية 45 درجة لمدة ساعتين عند 25 °C.

بعد ذلك، ارفع درجة الحرارة إلى 37 °C واحضن العينات لمدة 36 ساعة مع الرج اللطيف. بعد الطرد المركزي عند 16,000 ×g لمدة دقيقة واحدة، استخدم مكثف فراغي في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة لتبخير الماء. أعد تعليق العينات المجففة باستخدام 10 µL من الماء المسمى بـ O-18 والذي يحتوي على 50 units/mL من PNGase F. احضن العينات لمدة 36 ساعة عند 37 °C تحت الرج المستمر، ثم قم بإجراء هضم التريpsin في المحلول لجميع العينات وتابع عملية التنقية باستخدام C-18.

للبدء، أضف 200 µL من الميثانول إلى كل بئر في لوحة C-18 الدوارة لتنشيط الراتنج. قم بالطرد المركزي عند 1,000 ×g لمدة دقيقة واحدة. بعد ذلك، أضف 200 µL من 80%ACN و 0.1%TFA في الماء إلى كل بئر وقم بالطرد المركزي عند 1,000 ×g لمدة دقيقة واحدة.

بعد ذلك، أضف 200 µL من محلول يحتوي على 1% ACN و 0.1% TFA في الماء إلى كل بئر، ثم قم بالطرد المركزي لمدة دقيقة واحدة عند 1,000 ×g. كرر إضافة هذا المحلول وعملية الطرد المركزي مرتين. بعد ذلك، قم بتحميل العينات في آبار لوحة الطرد المركزي واطردها مركزياً عند 1500 ×g لمدة دقيقة واحدة. أعد تحميل السائل المتدفق وكرر عملية الطرد المركزي.

ثم أضف 200 µL من محلول يحتوي على 1%ACN و0.1%TFA في الماء إلى كل بئر، ثم قم بالطرد المركزي عند 1500 ×g لمدة دقيقة واحدة. كرر عملية إضافة هذا المحلول والطرد المركزي مرتين. بعد ذلك، أضف 170 µL من محلول يحتوي على 50%ACN و0.1%TFA في الماء إلى كل بئر وقم بالطرد المركزي عند 1500 ×g لمدة دقيقة واحدة.

كرر هذه الإضافة وعملية الطرد المركزي مرة أخرى. استخدم جهاز تركيز بالتفريغ لتجفيف المستخلص المجمع في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين. تُحفظ العينات المجففة عند 80 درجة مئوية حتى يحين وقت استخدامها.

بعد ذلك، أجرِ تحليل مطيافية الكتلة المتسلسلة مع الكروماتوغرافيا السائلة على العينات المخصصة لتقييم إشغال مواقع الغليكوزيل. أما بالنسبة للعينات المخصصة لتحليل الغلايكوببتيد المباشر، فابدأ أولاً بعملية وسم TMT zero القياسية كما هو موضح في البروتوكول النصي. وللبدء، أضف إلى كل 10 µL من عينة موسومة بـ TMT zero مقدار 50 µL من محلول الربط الموفر.

بعد ذلك، يتم توزيع 50 µL من معلق راتنج التقاط الغليكو المتجانس على أنابيب جديدة سعة 1.5 mL، وتُطرد مركزياً لمدة دقيقة واحدة عند 2500 ×g. يتم التخلص من السائل الطافي وإضافة 60 µL من العينة ومحلول منظم الربط إلى الأنابيب التي تحتوي على كريات الراتنج باستخدام الماصة للمزج. تُحضن الأنابيب في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة مع الرج بسرعة 1200 RPM. وبعد الطرد المركزي لمدة دقيقتين عند 2,000 ×g، يتم نقل السائل الطافي إلى أنابيب جديدة.

بعد ذلك، أضف 150 µL من محلول الغسيل المنظم إلى كل أنبوب راتنج باستخدام الماصة مع الخلط لبدء عملية الغسيل. يتم التحضين في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق مع الرج بسرعة 1200 RPM. وبعد الطرد المركزي عند 2500 ×g لمدة دقيقتين، انقل كل راشح إلى أنبوب تخزين الراشح المقابل لإتمام عملية الغسل.

كرر عملية الغسيل هذه مرتين إضافيتين. بعد ذلك، أضف 75 microliters من محلول الاستخلاص (elution buffer) واخلط باستخدام الماصة. قم بالتحضين في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق مع الرج بسرعة 1200 RPM.

قم بإجراء الطرد المركزي عند 2500 ×g لمدة دقيقتين، وانقل كل سائل طافٍ إلى أنبوب جديد سعة 1.5 milliliter. أضف 75 µL من محلول الاستخلاص (elution buffer) باستخدام ماصة للمزج، ثم كرر عملية التحضين والطرد المركزي للعينات. انقل كل ناتج استخلاص إلى الأنبوب المقابل له.

بعد طرد الرواسب للناتج المستخلص المجمع لمدة دقيقتين عند 2500 ×g، يتم نقل كل سائل طافٍ إلى أنبوب جديد لضمان الإزالة الكاملة للراتنج. بعد ذلك، استخدم مكثف تفريغ لتجفيف الناتج المستخلص لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. أعد تعليق الغليكو-ببتيدات المجففة في 15 µL من 2%ACN و 05%TFA في ماء مقطر مزدوج.

بعد ذلك، قم بإجراء تحليل مطيافية الكتلة كما هو موضح في البروتوكول المكتوب. في هذه الدراسة، يتم تحضير بروتينات المصفوفة خارج الخلية (ECM) من أنسجة القلب والأوعية الدموية لتحليل تكوين المصفوفة خارج الخلية باستخدام تقنية الكروماتوغرافيا السائلة والمطيافية الكتليّة الترادفية، بالإضافة إلى تحليل الغليكو ببتيدات المباشر وغير المباشر. تعتمد الاستراتيجية الأساسية على عمليات تحضين متتالية باستخدام كلوريد الصوديوم، وSDS، وهيدروكلوريد الغوانيدين، يتبعها تحليل الغليكو ببتيدات المباشر أو غير المباشر.

يتم مراقبة كفاءة الاستخلاص باستخدام هلامات الأكريلاميد من نوع bis-tris مع الصبغ بالفضة للتصور. ومن بين المستخلصات الثلاثة التي تم تحليلها، تظهر غالبية البروتينات السكرية للمادة الخلالية الخلوية (ECM) في حصص كلوريد الغوانيدين. وتكون البروتينات السكرية للمادة الخلالية الخلوية مزينة بسلاسل غليكان غليكوزامين كبيرة ومتكررة، إلى جانب سكريات قليلة التعدد متنوعة وقصيرة مرتبطة بروابط N و O.

تظهر كفاءة إزالة السكريات مع إضافة الإنزيمات التي تهضم الجليكانات الجليكوزامينية والإنزيمات التي تستهدف قليلة السكريات الأصغر المرتبطة بـ N و O. ثم يتم تحديد البروتينات السكرية من خلال وجود الأسبرجين منزوع الأميد والموسوم بالأكسجين 18 ضمن تتابعات NXT أو NXS. ويظهر هنا طيف كتلة ترادفي نموذجي بتقنية HCD لببتيد من الديكورين يحتوي على أسبرجين منزوع الأميد عند الموضع two 11.

يُستخدم بعد ذلك تكسير HCD ETD لتحليل مستخلص المصفوفة خارج الخلوية (ECM) المخصب بالبروتينات السكرية. ويسمح طيف الكتلة الترادفي ETD بتحديد خصائص تركيب الغليكان. وبمجرد إتقان هذه التقنية، ينبغي أن تستغرق حوالي أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع.

تسمح لنا دراسات البروتينوميات السكرية هذه باستكشاف الفسيولوجيا والباثولوجيا الخاصة بوظيفة التليف، ليس فقط من خلال التغيرات في البروتينوميات، ولكن أيضاً من خلال تركيب السكريات المرتبطة بها. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير العينات لدراسة غلكوزة البروتين باستخدام مطياف الكتلة. وعلى الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤى حول أمراض القلب والأوعية الدموية، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً على حالات باثولوجية أخرى في التليف الحجمي مثل الأمراض التنفسية أو السرطان.