تحليل ج- كيت يجند المروج باستخدام الكروماتين مناعي

الهدف العام من إجراء الترسيب المناعي للكروماتين هو تقييم الارتباط الناجم عن TGF beta 1 لعامل النسخ SMAD2 بعناصر ربط SMAD في مروج مجموعة C. يمكن لهذه الطريقة الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال البيولوجيا الخلوية مثل النسخ الجيني الناجم عن السيتوكين. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن لديها القدرة على إثبات الارتباط المباشر لعوامل النسخ والبروتينات التنظيمية الأخرى للنسخ بمواقع ربط الحمض النووي الخاصة بها في الجسم الحي.

قم بتنمية الخلايا إلى ما بين 70 و 80٪ من التقاء على ألواح زراعة الأنسجة التي يبلغ طولها عشرة سنتيمترات. تحفيز الخلايا وفقا للأهداف التجريبية. قم بإزالة وسط زراعة الأنسجة ، وأضف خمسة ملليلتر من محلول التثبيت.

ثم احتضان الخلايا لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة على منصة اهتزاز. قم بإزالة محلول التثبيت ، واغسل الخلايا مرتين ب 10 مل من الثلج البارد واحد X PBS. قم بإزالة X PBS وأضف خمسة ملليلتر من محلول إصلاح توقف الجلايسين.

بعد احتضان الخلايا لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة على منصة اهتزاز ، قم بإزالة محلول تثبيت توقف الجلايسين واغسل الخلايا مرتين ب 10 ملليلتر من الثلج البارد واحد X PBS. بعد إزالة PBS ، أضف ملليلترين من محلول كشط الخلايا وحصاد الخلايا باستخدام مكشطة الخلايا. ثم انقل الخلايا المحصودة إلى أنبوب مخروطي على الجليد.

الطرد المركزي للعينات لمدة 10 دقائق عند 600 مرة G, وأربع درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات في مليلتر واحد من مخزن مؤقت لتحلل الخلايا X ، واحتضانه على الثلج لمدة 30 دقيقة. بمجرد إعادة تعليق الحبيبات في المخزن المؤقت لتحلل الخلية ، انقل تعليق الخلية إلى خالط Dounce المثلج البارد ، وقم بإخراج لمدة 10 ضربات باستخدام مدقة من النوع B لتعطيل الخلية.

بعد ذلك ، انقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق ، وقم بالطرد المركزي للعينة لمدة 10 دقائق عند 2 ، 400 مرة جم ، وأربع درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 350 ميكرولتر من المخزن المؤقت لهضم النوى. بعد احتضان العينات لمدة خمس دقائق عند 37 درجة مئوية ، أضيفي نوكلياز المكورات الدقيقة واخلطهم عن طريق الدوامة.

احتضان العينات عند 37 درجة مئوية لمدة خمس إلى 20 دقيقة ، مع خلط العينات كل دقيقتين عن طريق الانعكاس. الوقت في بعض التركيز ، إذا كنت بين خطوط الخلايا ، فقد يتطلب الأمر تحسينا في حالة القص الأنزيمي دون المستوى الأمثل. يمكن العثور على إجراء قص بديل باستخدام الصوتيات المتوفرة تجاريا في بروتوكول النص.

بعد الحضانة باستخدام نوكلياز المكورات الدقيقة ، أضف سبعة ميكرولترات من EDTA البارد 0.5 مولار لإيقاف التفاعل. الطرد المركزي للعينات باستخدام الحمض النووي المنفصم لمدة 10 دقائق عند 16 ، 200 مرة درجة مئوية وأربع درجات مئوية. نقل الحمض النووي المنفصم المحتوي على مادة طافية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد.

Aliquot 50 ميكرولتر في أنبوب منفصل للطرد المركزي الدقيق ، لتأكيد القص الناجح للحمض النووي كما هو موضح في بروتوكول النص. استخدم الحجم المتبقي على الفور لترسيب المناعة أو قم بتخزينه عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. اجمع بين 10 إلى 25 ميكروغراما من الكروماتين المتقاطع المنفصم مع 25 ميكرولترا من الخرز المغناطيسي لبروتين G من درجة الترسيب المناعي.

ثم أضف 10 ميكرولترات من المخزن المؤقت لتخفيف الترسيب المناعي ، وميكرولتر واحد من كوكتيل مثبط الإنزيم البروتيني. بعد أربع ساعات من الحضانة ، أضف واحدا إلى 10 ميكروغرام من الجسم المضاد إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر. وأضف الماء المقطر إلى الحجم النهائي البالغ 100 ميكرولتر.

احتضان العينات على دوار من طرف إلى طرف لمدة أربع إلى 12 ساعة عند أربع درجات مئوية. بعد الحضانة ، ضع الأنابيب على حامل مغناطيسي. بمجرد أن تتجمع الخرزات المغناطيسية على جانب الأنبوب ، قم بإزالة المادة الطافية بعناية والتخلص منها.

اغسل الخرزات ثلاث مرات باستخدام 800 ميكرولتر من مخزن الغسيل الأول. لكل غسلة ، امزج الخرزات عن طريق قلب الأنبوب عدة مرات. بعد ذلك ، ضع الأنبوب على الحامل المغناطيسي وقم بإزالة عازلة الغسيل بعناية بمجرد أن تتجمع الخرزات المغناطيسية على جانب الأنبوب.

بعد ذلك ، اغسل الخرزات مرة واحدة باستخدام 800 ميكرولتر من محلول الغسيل باستخدام نفس الإجراء. بعد الغسيل ، أعد تعليق الخرزات في 50 ميكرولتر من محلول الشطف واحتضان العينات على دوار من طرف إلى طرف لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد بمساعدة الحامل المغناطيسي.

أضف ستة ميكرولترات من خمسة كلوريد صوديوم مولار لعكس الارتباط المتقاطع متبوعا بميكرولترين من البروتيناز K. بعد خلط العينات ، احتضنها لمدة ساعتين عند 65 درجة مئوية. في هذه المرحلة ، يمكن تحليل العينات مباشرة لمواقع ربط البروتين كما هو موضح في بروتوكول النص ، أو يمكن تخزينها عند 20 درجة مئوية تحت الصفر. لتأكيد ارتباط SMAD2 الناجم عن TGF beta 1 بمحفز SCF ، تم إجراء مقايسة الترسيب المناعي للكروماتين.

نتج عن علاج TGF beta 1 ارتباط SMAD2 بمحفز SCF في خطوط سرطان الكبد البشري ، HepG2 و Hep3B. في حالة عدم وجود تحفيز TGF beta 1 ، لم يلاحظ ارتباط SMAD. كعنصر تحكم إيجابي ، لتنشيط SMAD الناجم عن TGF beta 1 ، تم إجراء ترسيب مناعي للكروماتين ل PAI-1.

يعد مروج PAI-1 هدفا معروفا ل TGF beta و SMAD. تم تأكيد خصوصية الترسيب المناعي SMAD2 من خلال استخدام أجسام مضادة IgG غير محددة. لم يلاحظ ارتباط SMAD2 ب SBE بعد ترسيب المناعة باستخدام IgG.

لتأكيد ارتباط TGF Beta 1 الناجم عن STAT3 بجين TGF beta ligand ، تم إجراء فحوصات الترسيب المناعي للكروماتين باستخدام TGF beta 1 معالجة خلايا HepG2 و Hep3B. نتج عن علاج TGF beta 1 ارتباط STAT3 بموقع ربط STAT3 المفترض الثاني لجين TGF beta ، ولكن ليس بالموقع الأول. في هذا المثال، يعمل ارتباط STAT3 الموجب ب STB-2 كعنصر تحكم إيجابي داخلي.

على غرار تجربة الترسيب المناعي للكروماتين الأخرى ، لم يشاهد ارتباط STAT3 ب ST-2 بعد الترسيب المناعي باستخدام IgG. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في يوم أو يومين اعتمادا على الجسم المضاد إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم اتباع إرشادات سلامة المختبر والتحلي بالدقة العالية في كل خطوة من خطوات البروتوكول.

يجب اتخاذ الاحتياطات مثل فحص MSDS وارتداء معدات الحماية مثل القفازات والمعطف الأبيض ونظارات السلامة أثناء تنفيذ هذا الإجراء. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحليل ارتباط البروتين بتسلسلات ربط الحمض النووي المحددة. باتباع هذا البروتوكول ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل فحوصات المروج من أجل تأكيد الأهمية الوظيفية لارتباط البروتين بالحمض النووي الذي يظهره ترسيب المناعة في الكروماتين.