تجميع وتتبع التنمية المجتمعية الميكروبية داخل منصة ميكرويل صفيف

الهدف العام من هذه الطريقة هو إجراء تحليل متوازٍ عالي الإنتاجية لمجتمعات ميكروبية متعددة الأعضاء في بيئات محصورة باستخدام مصفوفات من الآبار الدقيقة السيليكونية. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنها تسمح بمسح متوازٍ عالي الإنتاجية للتفاعلات الميكروبية الموضعية الدقيقة ذات الأهمية في المجالات الصناعية والطبية والبيئية. ويمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجالات الطب الحيوي وعلم البيئة الميكروبية، مثل كيف تؤثر القيود المكانية المتأصلة في المقاييس الدقيقة على المعايير الحتمية والعشوائية لتطور المجتمع الميكروبي، وما هي التأثيرات الرئيسية لذلك على وفرة الأعضاء الميكروبية وتنظيمها؟

ابدأ بتجهيز مصفوفات الآبار الدقيقة. أولاً، قم بقص شرائح مصفوفات الآبار الدقيقة الفردية من رقائق السيليكون المطبوع عليها مصفوفات متعددة باستخدام قلم خدش ماسي. تحتوي كل شريحة فردية على مصفوفات فرعية من الآبار التي تتراوح أقطارها من 5 إلى 100 ميكرون بثلاث كثافات تباعد مختلفة.

على كل شريحة، يتكرر النمط الكامل للآبار أربع مرات أيضًا. بعد ذلك، قم بإعداد غرفة ترطيب باستخدام صندوق رؤوس الماصات ومنديل مبلل بمحلول PBS. ثم ضع قطرة بحجم 150 microliter من محلول BSA على كل شريحة واترك الشرائح في الصندوق لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.

في هذه الأثناء، يتم تحضير البكتيريا. قم بطرد مزرعة بكتيرية مركزياً ثم أعد تعليقها في 500 µL من وسط R2A طازج يحتوي على 2% من الجلسرين. بعد ذلك، قم بقياس كثافة المزرعة عند 600 nm واضبط التركيز لتصل الكثافة الضوئية إلى 0.02.

بعد تحضين الرقاقة، قم بإزالة محلول BSA واغسل الرقائق ثلاث مرات باستخدام PBS. وبعد عمليات الغسل، جفف الرقائق باستخدام غاز النيتروجين وأعدها إلى غرفة الترطيب. بعد ذلك، أضف 150 µL من معلق المزرعة إلى كل رقاقة جافة وحضّن الرقائق لمدة ساعة عند درجة حرارة 4 °C لإعطاء البكتيريا وقتاً كافياً للالتصاق بالآبار، مع ضمان بطء انقسام الخلايا لأي ملوثات محتملة.

لتحضير شريحة للتصوير، قم أولاً بإعداد غطاء شريحة مطلي بالأغاروز لكل شريحة. قم بإسالة حجم صغير من الأغاروز، حيث يلزم حوالي خمسة مليليترات لكل غطاء شريحة. بعد ذلك، اغسل أحد جانبي غطاء الشريحة بالإيثانول وضعه في منتصف شريحة زجاجية بحيث يكون الجانب المغسول للأعلى.

ثم ضع فاصلين من مادة PDMS بسماكة 1 mm على طول الحواف الطويلة لغطاء الشريحة، وحرك غطاء الشريحة بحيث يبرز منه 1 mm خارج الشريحة. الآن، صب كمية كافية من الأغاروز على غطاء الشريحة لتغطيته بالكامل. ثم استخدم شريحة زجاجية ثانية لتسوية الأغاروز للحصول على سماكة موحدة.

قم بتجهيز عدة مجموعات من الشرائح هذه بالتوازي. وعندما يبدأ الأجاروز في التصلب، انقل المجموعات إلى درجة حرارة 4 °C. وبعد التبريد لمدة 15 دقيقة، قم بقص الأجاروز الزائد حول أغطية الشرائح.

بعد ذلك، ضع التجمعات في أطباق بتري واحفظها عند درجة حرارة 4 °C. بعد تحضين الرقائق مع البكتيريا، اغمس الرقائق في ماء عالي النقاء واحدة تلو الأخرى لمدة 10 ثوانٍ لكل منها. ثم ضع الرقائق المبللة على حوافها فوق منديل ورقي حتى يتم تصريف معظم السائل.

الآن، قم بإزالة البكتيريا التي لم تستقر داخل الآبار. اقطع قطعة من الشريط اللاصق بطول شريحة السيليكون وألصقها بطبقة الباريلين الموجودة على السيليكون. ثم قم بنزع الشريط لإزالة طبقة الباريلين، واستعد فوراً لقلب الشريحة.

الآن، ضع الشريحة على مجموعة الشرائح بحيث تلامس الآبار الدقيقة مادة الأجاروز. كن حذرًا جدًا حتى لا تتحرك الشريحة أو تنزاح بمجرد ملامستها للأجاروز. الآن، انقل المجموعة كاملة إلى حامل الشرائح في غرفة التحكم البيئية المثبتة على المنصة، والتقط صورًا بنظام الفاصل الزمني (time-lapse) على مدار الـ 24 ساعة القادمة بالفاصل الزمني المطلوب وتحت تكبير 10x.

قم بمعالجة مجموعات الصور باستخدام برمجيات تقليدية متاحة مجانًا. أولاً، قم باستيراد تسلسل الصور. ولإجراء عملية المتوسط الحسابي، قم بتحميل صور التصحيح أو صور المجال المظلم.

ثم قم بإجراء طرح للخلفية. حدد قيمة لنصف القطر، مثل 135 بكسل، واختر paraboloid sliding. بعد ذلك، قم بطرح صورة المجال المظلم المتوسطة من صورة مجال الإضاءة المتوسطة عن طريق تحديد الصورتين واستخدام عملية subtract.

الآن، قم بتطبيق تصحيح الإضاءة كما يلي. اضبط العملية على Divide (قسمة)، وعيّن i1 لتكون صورة البئر، وعيّن i2 لتكون صورة التصحيح، وعيّن k1 ليكون متوسط صورة التصحيح، وعيّن k2 إلى صفر. ثم انقر على Create New Window (إنشاء نافذة جديدة).

لتقدير كمية النمو البكتيري في الآبار الدقيقة، ابدأ بتحديد المناطق ذات الأهمية باستخدام المكون الإضافي للمصفوفات الدقيقة (micro array plug in). في قائمة الخريطة، انقر فوق "إعادة تعيين الشبكة" (reset grid) وحدد الصفوف والأعمدة وأقطار الآبار. ثم من قائمة شكل منطقة الاهتمام (ROI shape)، اختر "دائرة" (circle).

لضبط مصفوفة منطقة الاهتمام (ROI) وفقاً للصورة، يمكن تحريك مصفوفة منطقة الاهتمام عن طريق الضغط على مفتاح ALT أو ALT+SHIFT واختيار منطقة الاهتمام العلوية اليسرى باستخدام الماوس. ولتغيير حجم مناطق الاهتمام، اضغط على مفتاح shift أثناء اختيار الجانب السفلي الأيمن من مصفوفة منطقة الاهتمام. ولضبط المسافات بين مناطق الاهتمام، اضغط على مفتاح shift أثناء سحب الجانب العلوي أو السفلي من المصفوفة.

بمجردما تتطابق مصفوفة مناطق الاهتمام (ROI) مع الآبار الموجودة في الصورة، انقر فوق Measure RT. بعد ذلك، سيتم إخراج جدول يحتوي على جميع القياسات لكل صورة أو نقطة زمنية، ويمكن نسخه إلى جدول بيانات لإجراء التحليل. تمت مقارنة نمو سلالتين من بكتيريا Pseudomonas aeruginosa، حيث تعبر إحدى السلالات بشكل بنيوي عن بروتينات مؤثرة سامة مرتبطة بإفرازات النوع السادس.

أما النوع الآخر فهو عرضة للإمراض من النوع السادس بسبب فقدان الوظيفة. ويعبر كلاهما عن بروتين فلوري مختلف. وقد تمت دراسة المزارع المشتركة بشكل طولي وفي أحجام آبار مختلفة.

تم استنبات البكتيريا بشكل فردي وكـمزرعة مشتركة. وتم تصوير نموها لمدة 20 ساعة على فترات زمنية مدتها 30 دقيقة. وبعد إجراء التصحيحات البرمجية على بيانات التصوير، تم رسم مسارات النمو الكمية.

في الزراعة المشتركة، لا تشير البيانات إلى حدوث تغيير كبير في النمو. وللمضي قدماً في التحليل، تم تطبيق كل مسار على دالة لوجستية معدلة بثلاثة معاملات: الإشارة القصوى، والمعدل الأقصى، ووقت التأخر. ويشير هذا التحليل إلى أن الزراعة المشتركة لهذه الأنواع كان لها تأثير ضئيل على نموها العام، وأن التباين الملاحظ في منحنيات النمو يعود على الأرجح إلى عوامل بيئية.

بمجرد إتقان هذه الطريقة، يمكن تنفيذ عملية الإعداد في غضون ساعات قليلة فقط إذا تم القيام بها بشكل صحيح. وأثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم توفر خلايا ذات نمو قوي لضبط قيم الكثافة الضوئية (OD) النهائية للخلايا بدقة، وذلك لضمان الحصول على طبقات موحدة من البرغي في تجميعات الرقاقة، مع ضرورة توخي الحذر أثناء خطوة إزالة غشاء الباريلين. وباتباع هذا الإجراء، يمكن الإجابة على تساؤلات مثل كيف يتغير التعبير الجيني داخل كل مجتمع كدالة في تكوين المجتمع وتنظيمه، وذلك عن طريق تحليل المادة الوراثية.

لا تنسَ أن العمل مع Pseudomonas aeruginosa قد يكون خطيراً، لذا يجب دائماً اتخاذ الاحتياطات اللازمة مثل ارتداء القفازات، والسترة الواقية، والنظارات الواقية، واتباع التقنيات التعقيمية المناسبة أثناء تنفيذ هذا الإجراء.