تجميع وتتبع التنمية المجتمعية الميكروبية داخل منصة ميكرويل صفيف
يونيو 6, 2017
ويعتمد تطوير المجتمعات الميكروبية على مجموعة من العوامل، بما في ذلك العمارة البيئية، وفرة الأعضاء، والصفات، والتفاعلات. يصف هذا البروتوكول بيئة الاصطناعية، ميكروفابريكاتد لتتبع في وقت واحد من الآلاف من المجتمعات الواردة في آبار فيمتوليتر، حيث يمكن تقريب العوامل الرئيسية مثل حجم المتخصصة والحبس.
الهدف العام لهذه الطريقة هو التحليل المتوازي عالي الإنتاجية للمجتمعات الميكروبية متعددة الأعضاء في البيئات المحصورة باستخدام مصفوفات آبار السيليكون الصغيرة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بفحص متوازي عالي الإنتاجية للتفاعلات الميكروبية الموضعية بدقة والتي تعتبر مهمة للصناعة والطب والبيئة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجالات الطب الحيوي والبيئة الميكروبية مثل كيف تقود القيود المكانية المتأصلة على المقاييس الدقيقة المعلمات الحتمية والعشوائية لتنمية المجتمع وما هي التأثيرات الرئيسية على وفرة الأعضاء الميكروبيين وتنظيمهم؟
ابدأ بإعداد مصفوفات الآبار الصغيرة. أولا ، قم بقص رقائق مصفوفة الآبار الدقيقة الفردية من رقائق السيليكون المطبوعة بمصفوفات متعددة باستخدام كاتب الماس. تحتوي كل شريحة فردية على مصفوفات فرعية من الآبار بأقطار تتراوح من خمسة إلى 100 ميكرون بثلاث كثافات تباعد مختلفة.
على كل شريحة ، يتم أيضا تكرار الشكل الكامل للآبار أربع مرات. بعد ذلك ، قم بعمل غرفة مرطبة باستخدام صندوق طرف ماصة ومنديل مبلل ب PBS. ثم ضع قطرة 150 ميكرولتر من محلول BSA على كل شريحة واحتضان الرقائق في الصندوق لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة.
في غضون ذلك تحضير البكتيريا. قم بتدوير المزرعة وأعد تعليقها في 500 ميكرولتر من وسط R2A الطازج مع اثنين بالمائة من الجلسرين. ثم قم بقياس كثافة الثقافة عند 600 نانومتر واضبط التركيز على كثافة بصرية تبلغ 0.02.
بعد حضانة الرقاقة ، قم بإزالة محلول BSA وشطف الرقائق ثلاث مرات باستخدام PBS. بعد الشطف ، جفف الرقائق بغاز النيتروجين وأعيدها إلى الغرفة المرطبة. بعد ذلك ، أضف 150 ميكرولترا من تعليق الثقافة إلى كل شريحة جافة واحتضان الرقائق لمدة ساعة عند أربع درجات مئوية حتى يكون لدى البكتيريا الوقت للالتصاق بالآبار ، لكن الانقسام الخلوي لأي تلوث محتمل يكون بطيئا.
لتحضير شريحة للتصوير ، قم أولا بعمل زلة غطاء مطلية بالأغروز لكل شريحة. قم بتسييل كمية صغيرة من الاغاروز ، هناك حاجة إلى حوالي خمسة ملليلتر لكل زلة غطاء. بعد ذلك ، اغسل جانبا واحدا من زلة الغطاء بالإيثانول وقم بتوسيطه على شريحة زجاجية مع الجانب المغسول لأعلى.
ثم ضع فواصل PDMS بسمك ملليمتر واحد على طول الحواف الطويلة لانزلاق الغطاء وقم بتحويل زلة الغطاء بحيث يتدلى ملليمتر واحد من الشريحة. الآن ، صب ما يكفي من الاغاروز على زلة الغطاء لتغطيتها بالكامل. ثم استخدم شريحة زجاجية ثانية لتسطيح الاغاروز إلى سمك موحد.
قم بإعداد العديد من مجموعات الشرائح هذه بالتوازي. عندما يبدأ الاغاروز في التصلب ، انقل التجميعات إلى أربع درجات مئوية. بعد 15 دقيقة من التبريد ، قم بقص الأغروز الزائد حول زلات الغطاء.
ثم ضع التجميعات في أطباق بتري وقم بتخزينها عند أربع درجات مئوية. بعد أن تحتضن الرقائق مع البكتيريا ، اغمس الرقائق في ماء نقي للغاية واحدة تلو الأخرى لمدة 10 ثوان لكل منها. ثم ضع الرقائق المبللة على حوافها فوق منديل حتى يجف معظم السائل.
الآن ، قم بإزالة البكتيريا التي لم تستقر في الآبار. قم بقص قطعة من الشريط بطول شريحة السيليكون وألصقها بطبقة الباريلين على السيليكون. ثم انزع الشريط لإزالة طبقة الباريلين واستعد على الفور لقلب الشريحة.
الآن ، ضع الرقاقة على مجموعة شرائح بحيث تكون الآبار الصغيرة على اتصال مع الاغاروز. احرص على عدم تحريك أو تحريك الرقاقة بمجرد ملامستها للأغروز. الآن ، انقل التجميع الكامل إلى حامل الشريحة لغرفة التحكم البيئي في سطح المسرح واحصل على صور بفاصل زمني خلال ال 24 ساعة القادمة في الفاصل الزمني المطلوب وأقل من تكبير 10x.
قم بمعالجة مجموعات الصور باستخدام البرامج التقليدية المتاحة مجانا. أولا ، قم باستيراد تسلسل الصورة. للحساب المتوسط، قم بتحميل صور التصحيح أو الحقل المظلم.
ثم قم بإجراء طرح الخلفية. قم بتوفير قيمة نصف قطرها مثل 135 بكسل وحدد القطع المكافئ المنزلق. بعد ذلك ، قم بإزالة متوسط صورة المجال المظلم من صورة حقل الإضاءة المتوسط عن طريق تحديد الصورتين واستخدام عملية الطرح.
الآن ، قم بتطبيق تصحيح الإضاءة على النحو التالي. اضبط العملية على القسمة ، واضبط i1 على صورة البئر ، واضبط i2 على صورة التصحيح ، واضبط k1 على متوسط صورة التصحيح ، واضبط k2 على الصفر. ثم انقر فوق إنشاء نافذة جديدة.
لتحديد نمو البكتيريا في الآبار الصغيرة ، حدد أولا المناطق ذات الأهمية باستخدام قابس المصفوفة الصغيرة. في قائمة الخريطة ، انقر فوق إعادة تعيين الشبكة وحدد الصفوف والأعمدة وأقطار البئر. ثم من قائمة شكل عائد الاستثمار، حدد دائرة.
لضبط مصفوفة عائد الاستثمار على الصورة، يمكن نقل مصفوفة عائد الاستثمار بالضغط على مفتاح ALT أو ALT+SHIFT وتحديد عائد الاستثمار العلوي الأيسر بالماوس. لتغيير حجم عائد الاستثمار، اضغط على مفتاح shift أثناء تحديد الجزء السفلي الأيمن من مصفوفة عائد الاستثمار. لضبط التباعد بين عائد الاستثمار، اضغط على مفتاح shift أثناء سحب الجانب العلوي أو السفلي من المصفوفة.
بمجرد أن تتلاءم مصفوفة عائد الاستثمار مع آبار الصورة، انقر فوق قياس RT. ثم سيتم إخراج جدول يحتوي على جميع القياسات لكل صورة أو نقطة زمنية ويمكن نسخه في جدول بيانات لتحليله. تمت مقارنة نمو سلالتين من Pseudomonas aeruginosa. تعبر سلالة واحدة بشكل أساسي عن بروتينات المستجيب السامة المرتبطة بإفرازات النوع السادس.
والآخر عرضة للإصابة بالتسبب في النوع السادس بسبب فقدان الوظيفة. كلاهما يعبر عن بروتين فلوري مختلف. تمت دراسة الثقافات المشتركة طوليا وبأحجام مختلفة من الآبار.
تم استزراع البكتيريا بشكل فردي وكثقافة مشتركة. تم تصوير 20 ساعة من النمو على فترات 30 دقيقة. بعد إجراء تصحيحات البرامج على بيانات التصوير ، تم رسم مسارات النمو الكمي.
في الثقافة المشتركة ، لا تشير البيانات إلى الكثير من التغيير في النمو. للمضي قدما في التحليل ، تم تركيب كل مسار لوظيفة لوجستية معدلة بثلاث معلمات ، الحد الأقصى للإشارة ، والحد الأقصى للمعدل ، ووقت التأخير. يشير هذا التحليل إلى أن الاستزراع المشترك لهذه الأنواع كان له تأثير ضئيل على نموها الكلي وأن تنوعها الذي شوهد في منحنيات النمو يرجع على الأرجح إلى العوامل البيئية.
بمجرد إتقانها ، يمكن تنفيذ الإعداد في غضون ساعات قليلة إذا تم تنفيذه بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن يكون لديك خلايا تنمو بقوة لضبط قيم OD النهائية للخلية بشكل صحيح للحصول على طبقات مثقاب موحدة في تجميعات الرقائق وأن تكون متيقظا أثناء خطوة تقشير الباريلين. باتباع هذا الإجراء ، يمكن معالجة أسئلة مثل كيف يتغير التعبير الجيني داخل كل مجتمع كدالة لتكوين المجتمع وتنظيمه ، عن طريق تحليل المواد الجينية.
لا تنس أن العمل مع Pseudomonas aeruginosa يمكن أن يكون خطيرا ، ويجب دائما استخدام الاحتياطات مثل القفازات والسترة والنظارات الواقية وتقنيات التعقيم المناسبة أثناء تنفيذ هذا الإجراء.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يحدد هذا البروتوكول طريقة لتحليل عالي الإنتاجية للمجتمعات الميكروبية في البيئات المحصورة باستخدام مصفوفات آبار السيليكون الدقيقة. يتيح تتبع التفاعلات الميكروبية المهمة في مجالات مختلفة، بما في ذلك الصناعة والطب.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم البيئة الميكروبية
- البحث الطبي الحيوي
- علم البيئة
الخلفية
- يتأثر المجتمعات الميكروبية بالبنية البيئية والتفاعلات بين الأعضاء.
- يمكن أن يوفر فهم هذه المجتمعات رؤى حول الأسئلة البيئية والطبية الحيوية.
- الطرق عالية الإنتاجية ضرورية لتحليل التفاعلات المعقدة.
- تستخدم هذه الدراسة البيئات المصنّعة مصغرًا لتتبع دقيق.
هدف الدراسة
- لتحليل المجتمعات الميكروبية متعددة الأعضاء في المساحات المحصورة.
- للتحقيق في كيفية تأثير القيود المكانية على تطور المجتمع.
- لاستكشاف التأثيرات على وفرة الأعضاء الميكروبية وتنظيمها.
الطرق المستخدمة
- تحضير مصفوفات آبار دقيقة من أشباه الموصلات المصقولة.
- استخدام المصفوفات التي تحتوي على آبار تتراوح من خمسة إلى 100 ميكرون.
- فحص التفاعلات الميكروبية بطريقة عالية الإنتاجية.
- التحليل المتوازي لديناميات المجتمع في البيئات المحصورة.
النتائج الرئيسية
- أظهر القدرة على تتبع آلاف المجتمعات الميكروبية في وقت واحد.
- حدد التفاعلات الرئيسية التي تتأثر بحجم المكان والانغلاق.
- قدم رؤى حول المعايير الحتمية والعشوائية لتطور المجتمع.
- سلط الضوء على أهمية هذه الطريقة للصناعة والتطبيقات البيئية.
الاستنتاجات
- تقدم هذه الطريقة نهجًا جديدًا لدراسة التفاعلات الميكروبية.
- تعزز فهم ديناميات المجتمع في البيئات المحصورة.
- يمكن للبحوث المستقبلية أن تبني على هذه النتائج لمعالجة التحديات البيئية والطبية الحيوية.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
This microwell array platform enables high-throughput parallel analysis of microbial community development in confined environments, supporting mechanistic de-risking in early discovery by quantifying spatial and interaction effects on microbial growth. The method provides predictive confidence in target validation by revealing how fine-scale spatial constraints influence deterministic and stochastic parameters of community dynamics, directly informing translational biomarker and preclinical model relevance. Its scalability and reproducibility support enterprise R&D workflows in antimicrobial target screening and phenotypic screening applications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying how spatial confinement alters microbial member abundance and organization in co-culture systems.
- Operational Value: Enables functional target validation through longitudinal tracking of fluorescently labeled strains in defined microwell environments.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by measuring growth trajectories and interaction effects under controlled niche sizes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by standardizing microbial seeding in arrays with well diameters from 5 to 100 microns.
- Operational Value: Ensures assay reproducibility through BSA passivation, controlled incubation, and agarose-coated imaging substrates that minimize evaporation and drift.
- Scalability Value: Enables parallel analysis of thousands of communities, supporting platform reuse across antimicrobial and pathogenicity studies.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Connects discovery-phase interaction data to preclinical continuity by modeling how spatial constraints affect pathogenic outcomes in Pseudomonas aeruginosa co-cultures.
- Mechanistic De-risking: Quantifies negligible growth effects in co-culture, helping de-risk false positives in target validation screens.
- Predictive Confidence: Uses modified logistic fitting of growth curves to extract maximum signal, rate, and lag time for comparative strain analysis.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from hypothesis testing to lead identification, providing quantitative interaction data that informs go/no-go decisions in antimicrobial target programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by revealing how spatial constraints drive community development parameters in multi-member systems.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized chip preparation, bacterial adhesion at 4°C, and time-lapse fluorescence imaging at 30-minute intervals over 20 hours.
- Analytics: Generates quantitative growth trajectories via background subtraction, illumination correction, and ROI-based fluorescence measurement, enabling statistical comparison of conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical relevance by modeling Type VI secretion-dependent interactions in Pseudomonas aeruginosa, a pathogen with biomedical significance.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for screening microbial interactions across industry, medicine, and environmental applications due to its parallel throughput and confined-environment precision.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through quantification of microbial interaction effects in spatially constrained environments.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via controlled chip preparation, fluorescence labeling, and automated image analysis workflows.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by de-risking mechanistic ambiguity in early-stage antimicrobial target identification.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on quantitative interaction data from high-throughput community arrays.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microbiology, fluorescence microscopy, and image analysis software for ROI setup and quantitative measurement.
- Depends on silicon microfabrication infrastructure, agarose-coated slide assemblies, and environmental control chambers for stable 24-hour imaging.
- Necessitates cross-team standardization of bacterial preparation, OD adjustment, and parylene removal steps to ensure well-specific adhesion.
- Requires adaptation considerations when extending beyond Pseudomonas aeruginosa to other microbial models due to surface chemistry and growth variability.
- Practical limitations include the need for aseptic technique when handling Pseudomonas aeruginosa and potential well-to-well variability in sub-10 micron features.
![[ميكروأرس] البوليمر لاكتشاف إنتاجية عالية من المواد الحيوية](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F3636.jpg%3Fv%3D2026-07-07T12%253A46%253A19.222Z&w=384&q=75)
