عزل الفئران الدهنية المشتقة من الأنسجة الاوعية الدموية الدقيقة شظايا كما وحدات الأوعية الدموية للهندسة الأنسجة

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل شظايا الأوعية الدموية الدقيقة من الأنسجة الدهنية للفئران لتوليد وحدات الأوعية الدموية لهندسة الأنسجة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال هندسة الأنسجة حول الأوعية الدموية في الجسم الحي لبدائل الأنسجة. تتمثل إحدى مزايا هذه التقنية في أنها تنتج قطاعات الأوعية الدموية الدقيقة تعمل بكامل طاقتها دون معالجة معقدة في المختبر يمكن زرعها على السقالات وزرعها في عيوب الأنسجة.

يمكن أيضا تطبيق هذه الطريقة على أنظمة أخرى مثل فحوصات تكوين الأوعية الدموية في المختبر لكشف الآليات الجزيئية التكمن وراء تكوين شبكة الأوعية الدموية الدقيقة وإعادة تشكيلها. ابدأ بوضع ذكر مخدر من النوع C57 أسود ستة فأر في وضع ضعيف تحت مجهر مجهر جراحي وتأكد من عدم الاستجابة لقرص إصبع القدم. شل حركة الكفوف بشريط وتطهير البطن.

بعد ذلك ، استخدم مقص تشريح لفصل طبقة البطن عن الأنسجة العضلية الأساسية وإجراء شق البطن في خط الوسط. افتح بشكل جانبي اللوحات من جدار البطن وحدد ثنائيا الخصيتين, البربخ ومنصات الدهون البربخية. ثم استخدم مقصا صغيرا وملقطا دقيقا لحصاد الضمادات الدهنية ، مع الحرص على عدم جمع أي أنسجة بربخية ووضع ضمادات الدهون في طبق بتري يحتوي على 15 مل من 37 درجة مئوية DMEM.

في غطاء التدفق الصفحي ، اغسل ضمادات الدهون في ثلاثة أطباق بتري منفصلة تحتوي على 15 مل من PBS وضع الدهون المغسولة في أنبوب بولي بروبلين فارغ سعة 14 مل. استخدم مقياس أنبوبي لتحديد حجم الدهون المحصودة. ثم استخدم مقصا ناعما لفرم الأنسجة الدهنية ميكانيكيا.

عند الحصول على تعليق أنسجة متجانس ، استخدم ماصة قياس سعة 10 مل لنقل الأنسجة المفرومة بمجلدين من الكولاجيناز NB 4G إلى قارورة إرلينماير سعة 50 مل تحتوي على قضيب تقليب 25 ملم. ضع القارورة في حاضنة زراعة الخلايا لمدة 10 دقائق تحت التحريك القوي. ثم لاحظ 10 مللي لتر من الأنسجة المهضومة تحت المجهر.

أصعب خطوة في إجراء العزل هذا هي تحديد الوقت المناسب لوقف الهضم. سيؤدي هضم ضمادات الدهون لفترة طويلة إلى تعليق خلية واحدة دون أي شظايا للأوعية الدموية الدقيقة. إذا كان الهضم يحتوي على شظايا الأوعية الدموية الدقيقة المشتقة من الأنسجة الدهنية الحرة بجوار الخلايا المفردة ، فقم بتحييد الإنزيم بمجلدين من PBS مكمل بنسبة 20٪ FCS ونقل تعليق وعاء الخلية إلى أنابيب بولي بروبلين جديدة.

احتضان المحلول لمدة خمس دقائق عند 37 درجة مئوية لفصل شظايا الأوعية الدموية الدقيقة عن الدهون المتبقية عن طريق الجاذبية. بعد ذلك ، استخدم ماصة دقيقة بسعة مل واحدة لإزالة مل واحد من المادة الطافية الدهنية الرئيسية بعناية متبوعة باستخدام ماصة دقيقة سعة 100 مل لإزالة باقي المادة الطافية حتى يبدو التعليق خاليا من الدهون. عند إزالة كل الدهون ، استخدم ماصة قياس 10 مل لتصفية تعليق وعاء الخلية من خلال مصفاة 50 ميكرون فوق أنبوب مخروطي سعة 50 مل ونقل التعليق المفلتر إلى أنبوب بولي بروبيلين جديد سعة 14 مل لكل جزء من الأوعية الدموية الدقيقة المعزولة.

اجمع كريات شظايا الأوعية الدموية الدقيقة عن طريق الطرد المركزي وقم بإزالة كل ما عدا آخر مل واحد من المادة الطافية من كل أنبوب. أعد تعليق الكريات في الأجزاء الفوقية المتبقية. بعد ذلك ، قم بنقل كل تعليق إلى أنابيب طرد مركزي مخروطية فردية سعة 1.5 مل وحبيبات شظايا الأوعية الدموية الدقيقة مرة أخرى لإعادة التعليق في الحجم النهائي المناسب من PBS و 20٪ FCS لتحليل المصب المخطط له.

هنا ، يظهر توزيع طول شظايا الأوعية الدموية الدقيقة المعزولة حديثا من ستة أو سبعة إلى اثني عشر شهرا من النوع C57 الأسود الستة ، مع متوسط طول يبلغ حوالي 42 ميكرومتر لوحظ. كما يوضح هذا التشويه التمثيلي لتعليق الأوعية الخلوية ، يتم ملاحظة شظايا الأوعية الدموية الدقيقة الكبيرة والمتوسطة والصغيرة وكذلك الخلايا المفردة عندما يتم هضم الأنسجة الدهنية بشكل كاف. يكشف التكبير العالي أن شظايا الأوعية الدموية الدقيقة تظهر مورفولوجيا ناضجة للأوعية الدقيقة مع أجزاء هرمية للأوعية الدقيقة.

توصيف شظايا الأوعية الدموية الدقيقة عن طريق قياس التدفق الخلوي إلى أنها تحتوي على خلايا بطانة إيجابية CD31 ، وخلايا الأوعية الدموية الإيجابية للعضلات الملساء ألفا ، والخلايا الجذعية الوسيطة الإيجابية CD117 ، وعلامة تعبر عن الخلايا. بعد البذر على بديل الجلد الجلدي ، يتم توطين شظايا الأوعية الدموية الدقيقة الأكبر حجما بشكل أساسي على سطح الغرسة مع اكتشاف بعض أجزاء الأوعية الدموية الشعرية داخل نوى الزرع. يكشف التلوين الكيميائي المناعي لشظايا الأوعية الدموية الدقيقة المصنفة أيضا عن تكوينات الأوعية الدقيقة الفسيولوجية مع شظايا تشبه الشرايين والوريدات والشعيرات الدموية.

بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال هذه التقنية في غضون ساعتين إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل شظايا الأوعية الدموية الدقيقة من الأنسجة الدهنية للفئران كوحدات للأوعية الدموية لهندسة الأنسجة.