منهجية تقديم ميكرورنا باستخدام النمط المصلي المسيطر المؤتلف الفيروسات المرتبطة بالغدة 9 لعلاج الأمراض العصبية العضلية في القوارض

الهدف العام من هذه الطريقة هو تحديد وتوصيل microRNA باستخدام ناقل فيروس مؤتلف مرتبط بالغدان. ثم قم بتسليمه إلى العضلات الهيكلية والخلايا العصبية الحركية للفئران ، وتقييم فعاليتها في تحسين الأنماط الظاهرية للمرض. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على السؤال المهم حول ما إذا كان يمكن استخدام استراتيجية إسكات قائمة على microRNA لعلاج الحالات العصبية العضلية.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي استخدام فيروس النمط المصلي 9 المرتبط بالغدة لتوصيل الحمض النووي الريبي الصغير من خلال الدورة الدموية الجهازية إلى الوتر الشوكي والعضلات الهيكلية للفئران ، لإسكات جين المرض المستهدف مباشرة. قسم مخزون بلازميد AAV-microRNA إلى 100 إلى 200 ميكرولتر تحتوي على حمولة فيروسية تتراوح من عشرة إلى مائة تريليون جينوم لكل مليلتر. بعد ذلك ، قم بتحميل حصة واحدة في حقنة ، وقم بتوصيل إبرة قياس 27 إلى 30.

الآن ، باستخدام جهاز تقييد الماوس القياسي ، قم بتأمين الماوس مع تعرض ذيله. بعد ذلك ، نظف الذيل بنسبة 70٪ كحول وضع وسادة دافئة تحت الذيل لمدة 30 ثانية لزيادة توسع الأوعية. الآن ، في الجزء البعيد من الذيل ، أدخل الإبرة في وريد الذيل مع وضع الشطبة لأعلى وبزاوية ضحلة ، حوالي 15 درجة.

ثم حقن الفيروس وانتظر بضع ثوان قبل إزالة الإبرة. بعد إزالة الإبرة ، استخدم ضغطا معتدلا باستخدام إصبعين لوقف أي نزيف. ثم أعد إلى قفص منزله.

أثناء حقن وريد الذيل ، ليس من غير المألوف رؤية وميض من الدم في محور الإبرة. أثناء الحقن ، يجب ألا تكون هناك مقاومة. إذا بدأ الذيل في التبييض والانتفاخ ، فقم بإزالة الإبرة وحاول مرة أخرى بالقرب من موقع الدخول السابق.

بالنسبة لهذه الاختبارات ، يجب أن يكون عمر الفئران أكبر من أربعة أسابيع ، وتأكد من جمع مقياس خط الأساس قبل العلاج. يجب أن تكون غرفة الاختبار هادئة ومظلمة دون إزعاج. أحضر الفئران إلى الغرفة قبل 30 دقيقة على الأقل من إجراء أي اختبارات.

لا تزعج خلال فترة التأقلم هذه. ابدأ باختبار الأسلاك المعلقة. التقط الماوس من ذيله وضعه في وسط الشبكة السلكية.

بعد ذلك ، ارفع الشبكة من 15 إلى 20 بوصة واقلب الشاشة ببطء لمنح الماوس الوقت لضبط قبضته. بمجرد قلب الشبكة بالكامل ، ابدأ المؤقت وسجل وقت السقوط. اسمح للماوس بتعليقه لمدة 60 ثانية ، إذا سقط في وقت أقرب ، ثم أعده إلى الشبكة وكرر الإجراء.

إذا الماوس لمدة 60 ثانية كاملة ، فقم بتسجيل 60 ثانية للنتيجة وأعد الماوس إلى قفصه. اسمح لكل فأرة ثلاث محاولات بتسليم 60 ثانية. خلاف ذلك ، سجل أطول وقت تعليق.

بعد القتل الرحيم للفأر ، احصد الحبل الشوكي ثم حصاد عضلات الفخذ والهيكل العظمي. لتقطيع تجميد الأنسجة المحصودة ، املأ نصفها وعاءا من الفولاذ المقاوم للصدأ ب 2-ميثيل بوتان واغمر الربع السفلي من الوعاء في النيتروجين السائل. انتظر دقيقتين قبل المتابعة.

بعد بضع دقائق ، انقل العينة إلى 2-ميثيل بوتان. عندما تتحول العينة إلى اللون الأبيض ، انقلها على الفور إلى وعاء مدمج في الثلج الجاف. في وقت لاحق ، قم بتخزين العينة على حرارة 80 درجة مئوية.

للتحليل الكيميائي الحيوي والقياس الكمي للحمض النووي الريبي الصغير ، ضع الأنسجة المحصودة في كريفيال وقم بتجميدها في النيتروجين السائل. ثم قم بتخزينه على حرارة 80 درجة مئوية. تم حقن الفئران SBMA بمائة تريليون جينوم من AAV microR-298 في عمر خمسة أسابيع.

الفئران SBMA الجين المعدل مستقبلات الاندروجين البشري مع جهاز بولي جلوتامين موسع بشكل غير طبيعي. بحلول عشرة أسابيع ، عادة ما تظهر عليهم علامات الأمراض العصبية العضلية. تم حصاد الحبل الشوكي القطني وعضلة الفخذ في عدة نقاط زمنية بعد العلاج للتحليل.

أظهر RT-PCR الكمي أن تعبير micro-R298 بلغ ذروته في العضلات الهيكلية بعد ثمانية أسابيع ، وأن التعبير بلغ ذروته في النخاع الشوكي في 12 أسبوعا. بعد عشرة أسابيع من الحقن ، تم الكشف عن GFP في كلا الأنسجتين. وتعبير GFP مترجم مع علامة الخلايا العصبية الحركية الكولين أسيتيل ترانسفيراز.

في تجربة متابعة ، تم حقن الفئران بشكل عشوائي بالفيروس ، أو السيارة ، في عمر سبعة أسابيع ، ثم تم وزنها وفحصها سلوكيا أسبوعيا ، حتى عمر 40 أسبوعا. بعد عشرة أسابيع من الحقن ، بدأت الفئران المعالجة في اكتساب الوزن وبدأت في إظهار أداء حركي محسن. كشف تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي أن العلاج يقلل من مستويات نسخ الواقع المعزز في الأنسجة المصابة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية توصيل الحمض النووي الريبي الصغير باستخدام ناقل فيروس مؤتلف مرتبط بالغض من خلال حقن الذيل العبثي. وكيفية إجراء المقايسات السلوكية التي يمكن أن تساعد في تقييم كفاءة الحمض النووي الريبي الصغير الذي تم تسليمه في تحسين ضمور الأطراف السفلية والضعف في الفئران. يمتد تأثير هذه التقنية إلى مناهج العلاج الجيني ، لأن العلاج الجيني الآمن والفعال يتطلب نقلا محددا للأنسجة المستهدفة للجين المعدل العلاجي.

خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما أدركنا أن المرض الناجم عن الكسب السام لآليات الوظيفة ، مثل SBMA ، سيستفيد من الإفراط في التعبير عن microRNAs التي تحدث بشكل طبيعي والتي تستهدف على وجه التحديد الإصلاح ثلاثي الأبعاد لنسخة المرض.