الإبر مخصصة لميكروينجيكشنز في الدماغ القوارض

الهدف العام من هذه المنهجية هو تحسين بروتوكول للحقن الدقيق في الدماغ باستخدام إبرة كوارتز مخصصة وقابلة لإعادة الاستخدام، والتي لا تسبب تلفاً نسيجياً يمكن رصده وتضمن توصيلاً موثوقاً حتى في المناطق العميقة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة عن أسئلة رئيسية في مجال العلوم العصبية، مثل الفسيولوجيا المرضية للأمراض التنكسية العصبية والأمراض النفسية، وتأثيرات العلاج الجيني والخلوى عبر النواقل الفيروسية والطعوم الخلوية. والميزة الرئيسية هي أن هذه الإبر لا تسبب أي تلف نسيجي يمكن رصده، مما ضمن توصيلاً موثوقاً في مناطق الدماغ العميقة.

تعتبر هذه الأنابيب فعالة من حيث التكلفة لإمكانية تنظيفها وإعادة استخدامها. لبدء هذا الإجراء، يتم تنظيف وتعقيم الشعيرات الرباعية (الكوارتز) عن طريق وضعها لمدة خمس دقائق في ماء مقطر، ثم خمس دقائق في ethanol بتركيز 99%، تليها خمس دقائق في diethyl ether.

بعد ذلك، تُترك الشعيرات تحت غطاء سحب الهواء لمدة ساعة واحدة على الأقل لتجف تماماً. وفي هذه الأثناء، يتم تحضير الإبر الطويلة والرفيعة باستخدام جهاز سحب الليزر. ثم توضع الإبر في طبق بتري سبق تنظيفه بـ 70% ethanol.

قم بتغطية الطبق بفيلم برافين بلاستيكي. بعد ذلك، قم بقطع الشعيرات الدموية باستخدام المشرط الدقيق. ثبت الإبرة بإحكام على طاولة المجهر وقم بتوجيه طرفها في منتصف شاشة الكمبيوتر.

في شريط القوائم، انقر على أيقونة القلم واستخدمها لرسم علامة تحدد موضع قطع الإبرة. من وظائف الشريط الجانبي، اختر علامة التبويب التي تحتوي على زر Start Cut للسماح لليزر بقطع النقطة التي تم تحديدها مسبقاً. وإذا لزم الأمر، قم بقطع الثقوب الجانبية عن طريق رسم علامة وتكرار إجراءات القطع دون تغيير موضع الإبرة.

بعد قطع الإبرة، قم بتوصيلها بمضخة تفريغ عبر أنبوب بلاستيكي. بعد ذلك، قم بتشغيل المضخة واضبط معدل التدفق الأمامي يدويًا على 3 µL في الدقيقة. ثم قم بشفط ethanol بتركيز 99% يليه الماء المقطر لإزالة الشوائب الناتجة عن عملية القطع.

بعد ذلك، اشفط الـ 99%ethanol مرة أخرى لتسهيل عملية التجفيف. لاحقاً، تُحفظ الإبر في طبق بتري مغطى بشكل مناسب حتى يوم الجراحة. ولإعادة استخدام الإبر، يتم تنظيفها في نهاية التجربة باستخدام المنظفات المناسبة و 70%ethanol لإزالة المحلول المحقون وبقايا الأنسجة المحتملة.

إذا لزم الأمر، يمكن حتى غلي هذه الإبر في أوانٍ زجاجية مخصصة مملوءة بالماء المقطر. في هذه الخطوة، اختر قائمة الإعدادات لمعايرة المضخة وفقاً لقطر الحجم الخاص بسرنجة الحقن المجهري. واضبط معدل التدفق عند 0.3 microliters per minute.

بعد ذلك، املأ محقنة سعة 10 milliliter بالماء المعقم. واستخدمها لملء محقنة الحقن المجهري وطقم أجزاء تجميع الحقن الخاص بمضخة الحقن المجهري اليدوية. بعد ذلك، قم بتوصيل الإبرة بطقم مضخة الحقن المجهري اليدوية.

افصل المحقنة سعة 10 milliliter عن محقنة الحقن المجهري مع دفع المكبس ببطء، وذلك لترك قطرة من الماء في الجزء العلوي من محقنة الحقن المجهري. بعد ذلك، أدخل المكبس في محقنة الحقن المجهري. الآن، قم بتوصيل محقنة الحقن المجهري بالمضخة واضبط معدل التدفق عند 0.3 microliters لكل دقيقة.

بعد ذلك، قم بتغيير معدل التدفق إلى 0.1 microliters per minute وابدأ في إجراء الجراحة. ولتنفيذ الجراحة، احلق رأس الحيوان ونظفه بمسحة كحولية. بعد ذلك، قم بتثبيت الجرذ في الإطار المجسم (stereotaxic frame).

قم بإجراء قطع طولي فوق الجمجمة باستخدام مشرط معقم. كن رفيقاً لتجنب النزيف المفرط. بعد ذلك، افتح فروة الرأس باستخدام ملعقة مسطحة، وضع مشابك جراحية على شرفات الجلد لإبقائها مفتوحة.

بمنتهى الرفق، قم بفصل السمحاق للكشف عن منطقة الـ bregma ومنطقة الجمجمة التي سيتم إدخال الإبرة من خلالها. بعد ذلك، قم بتثبيت الذراع على الإطار المجسم (stereotaxic frame) وحرّك طرف الإبرة إلى الأعلى مباشرة فوق الـ bregma، مع الحرص على عدم كسر طرفها. دوّن إحداثيات الـ bregma الأمامية الخلفية والإنسية الجانبية، ثم حرّك الإبرة إلى الإحداثيات المطلوبة.

بعد ذلك، اخفض الإبرة حتى يكاد طرفها يلامس الجمجمة، وحدد نقطة الحفر بعد رفع الذراع المجسمة قليلاً. احفر الجمجمة عند النقطة المحددة، مع الحرص على عدم إتلاف السحايا والدماغ. بعد ذلك، اقطع قطعة صغيرة من فيلم البارافين البلاستيكي وضعها على الجمجمة.

باستخدام الماصة سعة 10 µL، ضع قطرة من المحلول على فيلم البارافين البلاستيكي. أوقف عمل المضخة، واسحب دافع المضخة قليلاً لإنشاء فقاعة هواء صغيرة في الأنبوب الشعري عن طريق سحب مكبس سرنجة الحقن المجهري بلطف. اخفض طرف الإبرة حتى يصل إلى القطرة.

اسحب العينة عن طريق سحب مكبس سرنجة الحقن المجهري ببطء شديد، مع تجنب تكون أي فقاعات. أعد وضع دافع المضخة بحيث يكون ملامساً للمكبس، وقم بتشغيل المضخة بمعدل تدفق قدره 0.3 microliters per minute. بعد ذلك، انتظر حتى تتكون قطرة قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.

بعد ذلك، خفّض معدل التدفق إلى 0.1 microliters per minute. قم بعمل شق في الأم الجافية باستخدام إبرة ذات سن مائل من الفولاذ المقاوم للصدأ، ثم أنزل الإبرة ببطء للدخول إلى نسيج الدماغ. وعند الوصول إلى الموضع المطلوب، انزل مسافة إضافية قدرها 0.1 millimeters، ثم أوقف المضخة.

ارفع الذراع المجسمة بمقدار 0.1 millimeters وابدأ تشغيل المضخة مجددًا بمعدل 0.3 microliters في الدقيقة. بعد ذلك، ابدأ تشغيل المؤقت وعملية الحقن. راقب حركة الفقاعة أثناء الحقن.

في النهاية، أوقف المضخة وانتظر خمس دقائق قبل سحب الإبرة ببطء. وعندما يتم استخراج إبرة الكوارتز بالكامل، ابدأ بتشغيل المضخة مرة أخرى وتحقق من تكون قطرة عند طرف الإبرة. بعد ذلك، قم بسد الفتحة الموجودة في سطح الجمجمة باستخدام شمع العظام.

قم بإزالة مشابك الإرقاء وخياطة فروة الرأس. ادهن المنطقة المحيطة بالجرح بكريم مضاد حيوي وأعد الحيوان إلى القفص الأصلي. هذه مقاطع إكليلية بسماكة ثمانية ميكرومتر من أدمغة الجرذان عند مستوى الجسم المخطط.

توضح هذه الصورة الأضرار الناتجة عن حقن 2 µL من ACSF باستخدام إبرة من الفولاذ المقاوم للصدأ ذات طرف غير مدبب وقياس 26-gauge. وفي المقابل، لم يظهر المخطط المخطط (striatum) الذي حُقن بإبرة كوارتز أي أضرار يمكن اكتشافها. وتوضح هذه الصور الأخرى الأضرار الناجمة عن الإبرتين على مستوى الحصين الظهري (dorsal hippocampus).

لكن الإبرة الكوارتزية لم تتسبب في أي تلف يمكن اكتشافه. وقد أظهر توزيع صبغة Trypan blue نجاح عمليات الحقن باستخدام كلتا الإبرتين. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون ساعتين، شريطة أن يتم إجراؤها بشكل صحيح.

بعد اتباع هذه الإجراءات، يمكن تنفيذ كافة الخطوات ذات الصلة، مثل الجراحات الإضافية، للإجابة على تساؤلات مختلفة مثل التأثيرات الناجمة عن الأدوية. وقد مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال العلوم العصبية لاستكشاف تأثير السموم والأدوية، ومؤخراً، منتجات العلاج الجيني والخلوي في النماذج الحيوانية. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء الحقن المجهري في مناطق الدماغ العميقة دون إحداث أي آفات يمكن اكتشافها باستخدام إبر الكوارتز المخصصة.

لا تنسَ أن استخدام الكواشف و/أو مسببات الأمراض المفصولة بالليزر قد يكون خطيراً للغاية. لذا، يجب دائماً اتخاذ الاحتياطات اللازمة، مثل إجراءات السلامة الخاصة بالليزر واستخدام معدات الوقاية الشخصية، عند تنفيذ هذا الإجراء.