بروتوكولات ل C-بريك دنا الجمعية القياسية باستخدام Cpf1

توضح مقاطع الفيديو التالية بالتفصيل إجراء استخدام معيار C-Brick لتجميع أجزاء الحمض النووي باستخدام البروتين المرتبط ب CRISPR ، Cpf1. يمكن لهذه الطريقة أن تعزز تطوير تجميع الحمض النووي في مجال البيولوجيا التركيبية. مثل تسهيل بناء الدوائر الجينية المعقدة.

الميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي أنها مستقلة عن التسلسل وتسمح بالتجميع التكراري لتركيبات الحمض النووي. خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما لاحظنا أن Cpf1 كان يسترشد بالحمض النووي الريبي الفردي والحمض النووي التحفيزي الذي يتم تكديسه بعيدا. لذلك ، توليد DKNs.

سيوضح الإجراء شي يوان لي ، طالب دراسات عليا من مختبري. لإصلاح قوالب crRNA ، أعد تعليق قليل النوكليوتيدات الفردية في الماء الخالي من RNase إلى تركيز 10 ميكرومولار. إلى أنبوب PCR سعة 0.2 مليلتر ، أضف قليل النوكليوتيد العلوي ، قليل النوكليوتيد السفلي ، ومخزن مؤقت للتلدين 10x كما هو مفصل في المستند المصاحب.

تأكد من أن الحجم الإجمالي هو 50 ميكرولتر. يوضح هذا الجدول ستة قليل النوكليوتيدات السفلية المختلفة ، يجب إقران كل منها بشكل فردي مع الخيط العلوي ، T7-F. تمثل الأحرف الصغيرة التسلسل المراد نسخه في التسلسل الإرشادي ل crRNA.

ضع أنبوب PCR في جهاز التدوير الحراري. قم بتشغيل برنامج التلدين مع نزع النيتروجين الأولي عند 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق ، ثم التهدئة من 95 إلى 20 درجة مئوية مع انخفاض درجة مئوية واحدة في الدقيقة. بعد التلدين ، قم بإجراء النسخ على الفور عن طريق الجمع بين المنتج الملدن مع الماء الخالي من RNase ، ومخزن النسخ T-7 ، وخليط NTP ، ومثبط RNase المؤتلف ، وبوليميراز T-7 RNase في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر.

احتضان التفاعل في حمام مائي عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي ، استخدم مجموعة تنظيف وتركيز الحمض النووي الريبي لتنقية الحمض النووي الريبي المنسوخ. استخدم مقياس الطيف الضوئي للأشعة فوق البنفسجية لتحديد كمية الحمض النووي الريبي.

ثم قم بتخفيف الحمض النووي الريبي إلى تركيز 10 ميكرومولار. إذا لم يتم استخدام العينات على الفور ، فقم بتخزينها عند 80 درجة مئوية. يمكن إنجاز أجزاء C-Brick بعدة طرق.

في هذا القسم من الفيديو ، سيتم تجميع ثلاثة أشرطة بروتين كروموبروتين ، cjBlue و eforRed و amilGFP باستخدام طريقة التجميع السلسة. ابدأ بتصميم وطلب قليل النوكليوتيدات لتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل لأشرطة البروتين الكروموبروتين. عندما تصل قليل النوكليوتيدات ، أعد تعليقها في ماء فائق النقاء بتركيز 10 ميكرومولار.

بعد ذلك ، لإعداد تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل ، ضع 0.2 مليلتر أنابيب PCR على الجليد. أضف الماء عالي النقاء ، واثنين من المخزن المؤقت XPCR ، و DNTPs ، والبادئات الأمامية والعكسية ، وقالب البروتين الكروموبي ، وبوليميراز الحمض النووي عالي الدقة. ضع الأنابيب مباشرة في جهاز التدوير الحراري وقم بتشغيل البرنامج.

استخدم العينات على الفور ، أو قم بتجميدها وتخزينها على حرارة 20 درجة مئوية. بعد التضخيم ، قم بتنقية منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام مجموعة. بعد ذلك ، لهضم المتجه القياسي C-Brick مع BamH1 ، أضف الماء عالي النقاء ، والبلازميد ، والمخزن المؤقت 10x ، و BamH1 إلى الأنبوب.

احتضن لمدة تصل إلى ساعتين عند 37 درجة مئوية في حمام مائي. قم بتنقية الناقل الخطي باستخدام مجموعة تنظيف الجل. بعد التنظيف ، اجمع بين المتجه الخطي ، ومنتج PCR ، ومخزن التجميع السلس 5x ، وإنزيم التجميع السلس من مجموعة تجميع سلسة في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل.

تأكد من أن الحجم الإجمالي هو 10 ميكرولتر. ضع هذا في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد الحضانة ، استخدم العينات على الفور أو قم بتجميدها على الثلج وتخزينها على حرارة 20 درجة مئوية.

إلى 90 ميكرولترا من الإشريكية القولونية DH10B ، أضف 10 ميكرولتر من البناء. إجراء التحول الكيميائي. بعد ذلك ، انشر الخلايا المحولة على صفيحة LB ، واحتضانها عند 37 درجة مئوية.

في اليوم التالي ، حدد العديد من المستنسخة للاستزراع في خمسة مليلتر من أنابيب LB السائلة واحتضانها عند 37 درجة مئوية على شاكر عند 220 دورة في الدقيقة بين عشية وضحاها. استخرج البلازميد باستخدام مجموعة تحضير البلازميد. بعد ذلك ، حدد المستنسخة الصحيحة عن طريق تسلسل Sanger.

اعلم أن بناء مسارات C-Brick يمكن أيضا إنجازه من خلال تطبيق PCI التفاعلي ، أو عن طريق التقييد في الهضم الفوري لوسط T4 DNA ligase للربط. بعد ذلك ، لهضم ناقل C-Brick مع Cpf1 ، اجمع بين الماء الخالي من RNase ، والمخزن المؤقت 10x Cpf1 ، والبلازميد ، ومثبط RNase المؤتلف ، و Cpf1 في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر. لإدخال جزء من الحمض النووي غريب في مواقع T1 و T2 ، أضف ميكرولتر واحد من crRNA T2 ، واحتضن الأنبوب في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.

بعد ذلك ، مع الاحتفاظ بالأنبوب في الحمام المائي ، أضف ميكرولتر واحد من crRNA T1 ، وميكرولتر واحد من Cpf1 ، واحتضنه لمدة 30 دقيقة أخرى. تمت إضافة crRNA T2 أولا ، لأن موقعي التعرف أقرب إلى الحمض النووي المتجه. قد يؤثر ربط Cpf1 على موقع T1 على فراش موقع T2.

أيضا ، إذا كان موقع T2 يحل محل موقع T2 ، تعطيل موقع T2 إذا تمت إضافة crRNA T1 أولا. أضف ميكرولتر واحد من الفوسفاتيز القلوي الحساس للحرارة واحتضان الأنبوب في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة ساعة أخرى. قم بإجراء الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز وتنقية الناقل باستخدام مجموعة نظام تنظيف الجل.

استخدم العينات على الفور ، أو قم بتجميدها وتخزينها على حرارة 20 درجة مئوية. لهضم جزء الحمض النووي ذي الأهمية مع Cpf1 ، اجمع بين الماء الخالي من RNase ، والمخزن المؤقت 10x Cpf1 ، والبلازميد ، ومثبط RNase المؤتلف ، و Cpf1 في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر. لإدخال جزء من الحمض النووي غريب في مواقع T1 و T2 ، أضف ميكرولتر واحدا من crRNA T1 وميكرولتر واحد من crRNA T3 إلى الأنبوب واحتضانه في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين.

بعد الحضانة ، قم بإجراء الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز وتنقية الجزء باستخدام مجموعة تنظيف الجل. استخدم العينات على الفور ، أو قم بتجميدها وتخزينها على حرارة 20 درجة مئوية. بعد ذلك ، لربط جزء الحمض النووي الغريب في ناقل C-Brick ، اجمع بين المتجه الخطي وجزء الحمض النووي في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر.

أضف 10x T4 DNA Ligase Buffer و T4 DNA Ligase. ثم احتضن لمدة ساعتين عند 22 درجة مئوية. استخدم العينات على الفور ، أو قم بتجميدها وتخزينها على حرارة 20 درجة مئوية.

أضف 10 ميكرولتر من منتجات الربط إلى الخلايا المختصة بالقولونية الإلكترونية DH10B ، وقم بإجراء التحول الكيميائي. بعد ذلك ، انشر الإشريكية القولونية المحولة على ألواح LB ، واحتضنها عند 37 درجة مئوية. في اليوم التالي ، أضف عدة نسخ إلى أنابيب LB سائلة سعة 5 ملليلتر واحتضنها طوال الليل على شاكر عند 220 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية.

استخرج البلازميد باستخدام مجموعة تحضير البلازميد. بعد ذلك ، حدد المستنسخة الصحيحة عن طريق تسلسل Sanger. قم بإجراء جولة جديدة من تجميع C-Brick.

باستخدام العينة ، يمكن استخدام ما يسمى باستنساخ الكراك كناقل C-Brick جديد أو قطعة DNA لمزيد من التجميع التكراري ل C-Brick. تم تجميع ثلاثة أشرطة بروتين كرومو، cjBlue و eforRed و amilGFP كما هو موضح في هذا الفيديو. تم التعبير عن ثلاثة بروتينات كروموبروتينية في الإشريكية القولونية المزروعة على طبق.

بكتيريا التحكم السلبي ، التي لا تحتوي على بروتينات كروموبروتينات ، على اللوحة الرابعة. بعد ذلك ، تم تجميع كاسيتين للتعبير عن الألوان باستخدام معيار C-Brick لإنشاء المزيد من الألوان. تم التعبير عن ثلاثة بروتينات كروموبروتينات وثلاثة بروتينات كروموبروتينات مزدوجة مجمعة في الإشريكية القولونية المزروعة في وسط LB السائل.

من واحد إلى ستة ، التركيبات المعبر عنها هي eforRed ، واحد ، amilGFP ، اثنان ، cjBlue ، ثلاثة ، amilGFP بالإضافة إلى eforRed ، أربعة ، eforRed بالإضافة إلى cjBlue ، خمسة ، و amilGFP بالإضافة إلى cjBlue ، ستة. تم استزراع البكتيريا الملونة الموجودة على لوحة واحدة ، أو في أنبوب طرد مركزي واحد ، من استنساخ واحد تم التحقق منه. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في أسبوع واحد ، إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن جميع المواد يجب أن تكون خالية من RNase ، لإعداد siRNA وإزالة Cpf1. ما زلت أوصي ، لقد ساعد هذا التكتيك كوسيلة للباحثين في مجال البيولوجيا التركيبية لبناء عرض جيني لمسارات التمثيل الغذائي. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تجميع مسار الحمض النووي باستخدام معيار C-Brick.