التوسع و أديبوجينيسيس تحريض الأسلاف خلية شحمية من الأنسجة الدهنية حول الأوعية معزولة من قبل المغناطيسي تنشيط الخلايا الفرز

تتمثل الأهداف العامة لبروتوكولات العزل والتمايز هذه في الحصول على الخلايا السلفية الشحمية من الأنسجة الدهنية المحيطة بالأوعية الدموية ، والحث على تمايزها إلى خلايا شحمية ناضجة. تسمح هذه الطريقة بتحليل مجموعات الخلايا السلفية للخلايا الشحمية المحددة والمحددة من الأنسجة الدهنية المحيطة بالأوعية الدموية ، مع الحد الأدنى من التأثير على مورفولوجيتها وقابليتها للحياة وإمكانية التكاثر والتمايز. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بزيادة عزل الخلايا العارضة للمستضد لكل جرام من الأنسجة الدهنية ، مقارنة بفرز الخلايا التي يتم تنشيطها بالفلورة.

بعد التأكد من عدم الاستجابة لقرص إصبع القدم ، قم بعمل شق عمودي في خط الوسط على طول القص إلى منطقة العجان من الفئران ، للوصول إلى تجويف البطن. كشف الشريان المساريقي العلوي ، وأوعية مقاومة المساريق الصغيرة ، والشريان الأورطي الصدري ، وقطع جميع الوصلات بالمساريق والشريان الأورطي. اجمع الأنسجة الدهنية الغدد التناسلية وانقل ضمادات الدهون المعزولة إلى حاوية جديدة من محلول بيكربونات كريبس رينجر ، أو محلول KRBB ، مكملا بأكوام 10 مللي مولار.

انقل الأوعية إلى طبق بتري يحتوي على محلول KRBB ، وضع الطبق تحت مجهر تشريح. إزالة الأنسجة الدهنية حول الأوعية الدموية من أوعية مقاومة المساريقية الصغيرة والشريان الأورطي. في غطاء السلامة الحيوية ، انقل حوالي 50 ملليغرام من الأنسجة إلى أنبوب سعة 1.7 مليلتر يحتوي على 1 مليلتر من محلول الكولاجيناز من النوع الأول ، وقم بفرم الأنسجة إلى قطع من 1 إلى 3 ملليمترات.

من المهم فرم الأنسجة الدهنية بشكل كاف للسماح للكولاجيناز بالتسلل تماما إلى النسيج الضام. احتضان الشظايا عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز لمدة 1 ساعة. ثم قم بتصفية المادة المهضومة بالتتابع من خلال مصافي خلايا فردية 100 و 40 ميكرون في أنبوب سعة 50 ملليلترا.

اجمع المرشح الناتج عن طريق الطرد المركزي ، وأعد تعليق الحبيبات في 1 مليلتر من محلول تحلل كريات الدم الحمراء. انقل تعليق الخلية إلى أنبوب ميكروفوجي جديد سعة 1.7 ملليلتر لحضانة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، محمي من الضوء. ثم اجمع خلايا الكسر الوعائي اللحمي باستخدام طرد مركزي آخر وأعد تعليق الحبيبات في الوسط القاعدي للكسر الوعائي اللحمي للعد.

لعزل الخلايا السلفية الشحمية عن طريق فرز الخلايا المنشطة مغناطيسيا ، اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي ، وأعد تعليق الحبيبات في مخزن مؤقت لمنع فرز الخلايا المنشط مغناطيسيا عند 1 مرات 10 إلى الخلايا السادسة لكل تركيز مليلتر لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية. من الضروري أن تتم جميع خطوات العزل عند 4 درجات مئوية ، وليس فوق الجليد. بعد ذلك ، احتضان الخلايا ب 5 ميكرولتر من الفأر المترافق FITC المضاد ل CD34 لمدة 30 دقيقة.

اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي. ثم احتضان الخلايا ب 4 ميكرولترات من MicroBeads المضادة ل FITC في 96 ميكرولترا من مخزن فرز الخلايا المنشط مغناطيسيا لمدة 5 دقائق في الظلام. أثناء احتضان الخلايا ، ضع عمودا متعدد الفرز في الفاصل المغناطيسي مع أنبوب نفايات سعة 5 ملليلتر أسفل العمود.

اشطف العمود ب 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت لفرز الخلايا المنشط مغناطيسيا ، وتخلص من النفايات السائلة وأنبوب النفايات. ثم ضع أنبوبا جديدا أسفل العمود ، وقم بتحميل الخلايا في الجزء العلوي من العمود ، وجمع الخلايا السالبة CD34 غير المسماة في أنبوب التجميع الجديد. عندما تمر جميع الخلايا عبر الجزء العلوي من العمود ، اغسل العمود 3 مرات باستخدام 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت لفرز الخلايا المنشطة مغناطيسيا منزوع الغازات ، مع الاستمرار في تجميع الشطف في أنبوب التجميع.

بعد الغسيل الأخير ، انقل العمود إلى أنبوب تجميع جديد ، واستخدم مكبس العمود لطرد 1 مليلتر من مخزن فرز الخلايا المنشط مغناطيسيا عبر العمود إلى الأنبوب ، لجمع الخلايا الإيجابية CD34. اجمع الخلايا السلفية الشحمية عن طريق الطرد المركزي. ثم احتضان الجزء الموجب CD34 في 10 ميكرولتر من مستقبلات عامل النمو المضاد للصفائح الدموية المشتق من الأرانب ألفا لمدة 30 دقيقة.

في نهاية الحضانة ، قم بالطرد المركزي للخلايا مرة أخرى ، واحتضان الحبيبات في 4 ميكرولترات من IgG MicroBeads المضادة للأرانب في 96 ميكرولترا من مخزن فرز الخلايا المنشط مغناطيسيا لعزل الخرزة المغناطيسية لخلايا ألفا الإيجابية لمستقبلات عامل النمو المشتق من الصفائح الدموية ، كما هو موضح للتو. لزراعة الخلايا السلفية لمستقبلات عامل النمو الإيجابية المشتق من الصفائح الدموية CD34 ، قم بزرع الخلايا في ألواح زراعة الأنسجة الفردية المكونة من 6 آبار في وسط قاعدي ، ووضع الألواح في حاضنة ثقافة خلايا ثاني أكسيد الكربون 37 درجة مئوية و 5٪. بعد 3 مقاطع تسلسلية ، قم بزرع الخلايا في صفائح زراعة الأنسجة السوداء المكونة من 96 بئر في 1 مرات 10 إلى خليتين لكل بئر ، وقم بتقييم تكاثرها في 8 و 24 و 48 و 96 ساعة في 5 مرات 10 إلى الخلايا الرابعة لكل بئر ، في لوحات فحص 24 بئر ، وفقا لبروتوكولات فحص الانتشار القياسية.

للحث على تكوين الشحم ، عندما تصل ثقافة الخلايا السلفية الشحمية إلى التقاء ، قم بتغذية الخلايا بالوسط القاعدي السلف للخلايا الشحمية لمدة 48 ساعة ، ثم عالج الثقافات بالبروتين المورفوجينيك للعظام 4 لمدة 48 ساعة أخرى. في اليوم الثالث ، استبدل الوسط بوسيط تحريض الخلايا السلفية للخلايا الشحمية ، بدون IBMX وفحص الميثازون لمدة 14 يوما. يمكن بعد ذلك تقييم درجة adipogenesis في الثقافات في 1 في 1 في 10 إلى الخلايا 4 لكل بئر في لوحات ثقافة الأنسجة 48 جيدا ، وفقا لبروتوكولات فحص adipogenesis القياسية.

على الرغم من أن كلتا الطريقتين تظهران توزيعا مشابها لمجموعة الخلايا وقابليتها للحياة ، إلا أن عزل فرز الخلايا المنشط مغناطيسيا ينتج عددا أكبر من الخلايا للثقافة ، مقارنة بفرز الخلايا التي يتم تنشيطها بالفلورة. في هذه التجربة التمثيلية ، تم تقييم التكاثر المختبري للجزء الوعائي اللحمي المصنف للخلايا المنشطة مغناطيسيا والخلايا السلفية الشحمية ، المعزولة من الشريان الأورطي الصدري ، وأوعية مقاومة المساريقية الصغيرة ، والأنسجة الدهنية الغدد التناسلية لذكور الفئران ، في 8 و 24 و 48 و 96 ساعة بعد الطلاء ، باستخدام اختبار الحمض النووي الكمي. لم يلاحظ أي اختلافات في الموقع في معدلات تمدد الكسر الوعائي اللحمي في أي وقت ، باستثناء الخلايا السلفية للخلايا الشحمية من الشريان الأورطي الصدري ، والتي أظهرت انتشارا أقل بمقدار 96 ساعة ، مقارنة بخلايا الأوعية الدموية اللحمية من نفس الموقع.

يؤدي تحفيز الخلايا السلفية للخلايا الشحمية المتقاربة بالبروتين المورفوجينيك للعظام 4 لمدة 48 ساعة إلى تمايز الخلايا الشحمية ، كما يتضح من تراكم الدهون في القطرات ، كما تم تقييمه بواسطة كل من مقايسة امتصاص الدهون الفلورية ، وتلوين Oil Red O. بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال هذه التقنية في 8 ساعات ، إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر الحفاظ على درجات حرارة 4 درجات مئوية أثناء خطوات العزل.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل الخلايا السلفية للخلايا الشحمية وتمييزها.